魷魚墨多糖在上皮細(xì)胞的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)及小鼠體內(nèi)的消化吸收研究.pdf

1、魷魚墨是一種很有潛力的天然藥物資源，在我國(guó)有著悠久的藥用歷史，但是在魷魚加工中，墨囊通常作為廢棄物而丟棄。魷魚墨多糖近年來(lái)被證實(shí)具有多種生理活性，如提高免疫力、抗腫瘤、化療保護(hù)、抗氧化、改善腸道粘膜免疫等。目前魷魚墨多糖相關(guān)研究多集中于其生物活性上，尚無(wú)魷魚墨多糖消化吸收方面的研究。本文主要目的是通過(guò)體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)探討魷魚墨多糖的消化吸收機(jī)制，有助于更有效地開發(fā)其生物活性，為魷魚墨多糖應(yīng)用于食品、保健領(lǐng)域以及臨床應(yīng)用提供了一定的理論基礎(chǔ)。

2、本文主要研究工作如下:
　　1)魷魚墨多糖的提取及制備多糖抗體:處理北太平洋魷魚墨囊，提取純化獲得魷魚墨純多糖SIP，將SIP與BSA偶聯(lián)獲得人工抗原，經(jīng)動(dòng)物免疫獲得抗多糖血清，血清純化后檢測(cè)抗體濃度及其效價(jià)。結(jié)果顯示經(jīng)過(guò)酶法提取、乙醇沉淀和三氯乙酸除雜蛋白，冷凍干燥后粗多糖得率約為1.5％（m/v），多糖經(jīng)離子交換色譜和凝膠滲透色譜分級(jí)純化，多糖純度達(dá)到95％以上。四只新西蘭大白兔的血清抗體濃度分別為A兔2.506mg/mL、B

3、兔2.942mg/mL、C兔2.602mg/mL、D兔2.605mg/mL，ELISA法檢測(cè)效價(jià)篩選出最優(yōu)抗體A兔抗為1∶3200。
　　2)利用魷魚墨多糖抗體研究多糖在腸上皮細(xì)胞的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn):利用魷魚墨多糖SIP孵育MDCK單層細(xì)胞后經(jīng)多聚甲醛固定，結(jié)合免疫組化的方法利用多糖抗體追蹤定位多糖。結(jié)果表明SIP(200μg/mL)孵育1h后激光共聚焦顯微鏡下在MDCK細(xì)胞內(nèi)追蹤到微弱的多糖信號(hào)。由于多糖信號(hào)不強(qiáng)而需要更為靈敏的方法進(jìn)行

4、研究，接下來(lái)的章節(jié)采用熒光標(biāo)記法和色譜法結(jié)合來(lái)研究魷魚墨多糖的消化吸收。
　　3)魷魚墨多糖的熒光標(biāo)記及其化學(xué)檢測(cè):利用熒光素FTSC通過(guò)酰胺反應(yīng)對(duì)魷魚墨多糖SIP進(jìn)行熒光標(biāo)記并利用TLC法、UV法、3Dscan、HPLC法驗(yàn)證其化學(xué)特性。結(jié)果顯示TLC法中SIP在原點(diǎn)處發(fā)熒光，無(wú)游離熒光素，表明SIP已經(jīng)成功標(biāo)記。熒光多糖SIP-FTSC與SIP相比，在410～530nm范圍內(nèi)產(chǎn)生了特征吸收峰，SIP-FTSC與FTSC的熒光特

5、性類似，得到Ex=495nm Em=518nm，該特性通過(guò)HPLC中RID檢測(cè)器和FLD檢測(cè)器得到驗(yàn)證。最后對(duì)標(biāo)記條件進(jìn)行了優(yōu)化，最終采用條件為熒光素含量FTSC∶SIP=0.06∶1，反應(yīng)時(shí)間12h，催化試劑比值EDC∶NHS∶SIP=4∶4∶1。
　　4)利用熒光標(biāo)記多糖研究多糖在腸上皮細(xì)胞的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)和體內(nèi)吸收:SIP-FTSC孵育Caco-2三維細(xì)胞，對(duì)熒光多糖在三維細(xì)胞模型的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)行定位追蹤和定量研究，同時(shí)用SIP-F

6、TSC灌胃小鼠，研究其體內(nèi)消化吸收狀態(tài)。結(jié)果顯示在200μg/mL濃度下，15min能在極少數(shù)Caco-2細(xì)胞中追蹤到SIP-FTSC熒光信號(hào)，并驗(yàn)證此時(shí)actin，ZO-1，E-cadherin為完好無(wú)損狀態(tài);BL側(cè)SIP-FTSC含量極低，轉(zhuǎn)運(yùn)量、轉(zhuǎn)運(yùn)率和Papp均隨時(shí)間的增長(zhǎng)而增長(zhǎng)，120min時(shí)轉(zhuǎn)運(yùn)量?jī)H有1.921μg/cm2，轉(zhuǎn)運(yùn)率僅為1.06％，Papp為1.4394×10-6cm/s。小鼠灌胃SIP-FTSC后，能夠在血清