甘露糖結(jié)合凝集素在IgA腎病中作用及其分子機制的初步研究.pdf

1、IgA腎病是全世界范圍內(nèi)最常見的腎小球腎炎，占原發(fā)性腎小球腎炎的20-45％。IgA腎病臨床及病理表現(xiàn)多種多樣，超過三分之一的患者在發(fā)病后20-25年可進展為終末期腎臟病。因此尋找可靠的標記物來科學(xué)評估IgA腎病的嚴重程度和預(yù)后以及探討其疾病進展機制顯得至關(guān)重要。
　　 甘露糖結(jié)合凝集素(Mannose binding lectin，MBL)是一種進化保守、可循環(huán)的膠原凝集素，主要由肝臟合成，存在于人體血清中，具有C1q的膠原主

2、莖和凝集素結(jié)構(gòu)域。MBL與C1q具有同源結(jié)構(gòu)，能與不同微生物表面的糖基結(jié)合;還可與免疫球蛋白及免疫復(fù)合物結(jié)合。MBL在人體內(nèi)發(fā)揮多種作用，參與多種疾病的發(fā)生與進展，如在感染性疾病及抵抗病原體的過程中發(fā)揮保護性的作用;在系統(tǒng)性紅斑狼瘡、皮肌炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等自身免疫性疾病中也發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用;甚至還與糖尿病、缺血再灌注損傷以及嚴重的冠狀動脈疾病和/或斑塊的形成有關(guān)。但MBL在IgA腎病中的作用及機制尚未明確。
　　 近年來尿液

3、標本因其無創(chuàng)、簡單易得并能直接反映腎小球疾病而廣受關(guān)注。既往有研究顯示造影劑腎病患者尿液MBL水平可明顯升高，但迄今為止尿液MBL水平在IgA腎病中的意義尚無報道。本研究中，我們將探討尿液MBL水平在評估IgA腎病疾病嚴重程度以及判斷其預(yù)后方面的重要意義。
　　 另有研究發(fā)現(xiàn)部分IgA腎病患者腎組織中存在MBL沉積。但是關(guān)于MBL在腎組織中沉積的意義尚未得到統(tǒng)一的結(jié)論。本研究中我們將評價腎小球MBL沉積在評估IgA腎病疾病嚴重程

4、度中的意義，并根據(jù)隨訪數(shù)據(jù)探討MBL沉積與腎臟緩解之間的關(guān)系。
　　 IgA腎病主要的病理特點是系膜細胞及系膜基質(zhì)的增生，免疫病理表現(xiàn)為IgA（主要是IgA1）并常伴有補體成分沉積于腎小球系膜區(qū)。我們應(yīng)用共聚焦顯微鏡觀察MBL在腎組織中的定位，結(jié)果發(fā)現(xiàn)MBL與纖連蛋白（系膜細胞標記物）共同沉積于腎小球系膜區(qū)。
　　 腎小球系膜細胞是一種功能活躍的腎小球固有細胞，它能夠維持腎小球毛細血管網(wǎng)結(jié)構(gòu)的完整性;通過其收縮功能，改變

5、血流量和濾過面積來調(diào)節(jié)腎小球濾過率;分泌細胞外基質(zhì)蛋白、生長因子、細胞因子等生物活性物質(zhì);攝取免疫復(fù)合物及大分子物質(zhì)等。
　　 NF-κB是介導(dǎo)細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要轉(zhuǎn)錄因子，參與免疫調(diào)節(jié)、炎癥反應(yīng)和細胞生長，其在調(diào)節(jié)腎小球系膜細胞的活化及腎臟的炎癥損傷中居于核心地位。NF-κB以同源或異源二聚體的形式廣泛存在于真核細胞內(nèi)。p65是NF-κB的亞基，通常情況下通過檢測p65的表達水平來判定NF-κB是否活化。
　　 根據(jù)前

6、期的研究結(jié)果，我們推測MBL可能在腎組織局部與系膜細胞發(fā)生相互作用，這種相互作用可能與IgA腎病的進展有關(guān)。為驗證這一假設(shè)，我們以人腎系膜細胞為工具細胞，探討MBL對人腎系膜細胞生物學(xué)行為的影響，并進一步研究MBL與NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的關(guān)系，從而為明確IgA腎病疾病進展的機制提供線索和依據(jù)。
　　 實驗材料及方法：
　　 連續(xù)入選腎活檢證實的原發(fā)性IgA腎病患者，年齡及性別匹配的健康體檢者作為正常對照。ELISA法檢

7、測IgA腎病患者尿液MBL水平，收集并記錄患者的一般臨床、病理資料并進行規(guī)律隨訪，分析IgA腎病患者尿液MBL水平與臨床和病理預(yù)后因子以及腎臟緩解之間的關(guān)系。
　　 連續(xù)入選腎活檢證實的原發(fā)性IgA腎病且具有充分腎組織（切片中含5個或以上腎小球）的患者。免疫熒光法檢測腎組織中MBL的沉積;為明確MBL在腎組織中沉積的部位，進行MBL和纖連蛋白（一種系膜細胞標記物）的免疫熒光雙染，共聚焦顯微鏡進行觀察。收集并記錄患者的一般臨床及病

8、理資料，分析IgA腎病患者腎組織MBL沉積情況與臨床和病理預(yù)后因子以及腎臟緩解之間的關(guān)系。
　　 MTT試驗檢測系膜細胞的生長情況。應(yīng)用30％體積分數(shù)的去MBL正常人血清、去MBL的IgA腎病患者血清以及加入不同濃度rMBL（0.2μg/ml、0.5μg/ml、1μg/ml、2μg/ml、5μg/ml）的IgA腎病患者血清孵育人腎系膜細胞72小時，之后行MTT檢測。3次實驗結(jié)果用于統(tǒng)計學(xué)分析。
　　 流式細胞術(shù)檢測細胞周

9、期及凋亡情況。應(yīng)用30％體積分數(shù)的去MBL正常人血清、去MBL的IgA腎病患者血清和加入1μg/ml rMBL的IgA腎病患者血清孵育人腎系膜細胞72小時，流式細胞術(shù)檢測三組系膜細胞周期及凋亡情況。3次實驗結(jié)果用于統(tǒng)計學(xué)分析。
　　 對rMBL（1μg/ml）+IgA腎病血清刺激后的系膜細胞進行MBL的免疫熒光染色，通過激光掃描共聚焦顯微鏡進行分層掃描，以明確MBL在系膜細胞的定位。
　　 免疫印跡法檢測細胞周期關(guān)鍵蛋白

10、Cyclin B1、Cyclin D1及凋亡相關(guān)蛋白caspase、Bcl-2的表達，以進一步探討MBL對系膜細胞細胞周期及凋亡的影響。
　　 免疫印跡法檢測p65的表達。ELISA法檢測系膜細胞上清液中MCP-1、IL-6的蛋白濃度，3次實驗結(jié)果進行統(tǒng)計學(xué)分析。
　　 結(jié)果：
　　 1、IgA腎病患者(n=162)尿液MBL水平明顯高于正常對照組(n=50)。
　　 2、伴有高血壓的IgA腎病患者尿MB

11、L水平明顯高于無高血壓的IgA腎病患者;尿MBL水平與血肌酐、尿蛋白、血清C4水平呈正相關(guān)，與eGFR呈負相關(guān)。
　　 3、隨著Lee分級病理表型加重，尿MBL水平明顯升高;存在明顯系膜細胞增生、腎小球節(jié)段硬化、內(nèi)皮細胞增生以及小管間質(zhì)損傷者，尿MBL水平明顯升高。
　　 4、隨訪數(shù)據(jù)表明腎臟未緩解的IgA腎病患者尿MBL水平明顯高于腎臟緩解者。
　　 5、131例IgA腎病患者腎組織用于MBL免疫熒光染色，其中

12、45例(34.35％)腎組織中存在MBL沉積，表現(xiàn)為彌漫或節(jié)段性沉積。共聚焦顯微鏡檢發(fā)現(xiàn)MBL與纖連蛋白共同沉積于腎小球系膜區(qū)。
　　 6、與不存在MBL沉積者相比，存在MBL沉積的IgA腎病患者血肌酐、尿蛋白及高血壓患者比例更高，但eGFR及血清白蛋白水平明顯降低。
　　 7、隨著Lee分級病理表型的加重，腎小球MBL沉積的患者比例明顯增加;根據(jù)牛津分級標準，存在MBL沉積的患者病理改變也更重，表現(xiàn)為更多患者存在明顯的

13、系膜細胞增生、腎小球節(jié)段硬化、內(nèi)皮細胞增生以及小管間質(zhì)損害。
　　 8、存在腎小球MBL沉積的患者腎臟緩解率明顯低于無MBL沉積者。
　　 9、MTT試驗檢測細胞的生長情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)rMBL（1μg/ml）+IgA腎病患者血清孵育的人腎系膜細胞OD值出現(xiàn)比較明顯的下降，提示此時系膜細胞的生長受到抑制。
　　 10、激光掃描共聚焦顯微鏡分層掃描結(jié)果顯示MBL可通過細胞膜進入細胞漿。
　　 11、流式細胞術(shù)檢

14、測細胞周期，結(jié)果顯示正常血清組、IgA腎病血清組及rMBL（1μg/ml）+IgA腎病血清組之間不同細胞周期的系膜細胞比例沒有明顯差別。免疫印跡法檢測細胞周期關(guān)鍵蛋白Cyclin B1和Cyclin D1的表達，結(jié)果顯示三組系膜細胞Cyclin B1和Cyclin D1的表達沒有明顯差異。
　　 12、流式細胞術(shù)（Annexin（V）/PI雙染法）檢測上述細胞凋亡情況，結(jié)果顯示rMBL（1μg/ml）+IgA腎病血清組細胞早期凋

15、亡率明顯高于正常血清組及IgA腎病血清組。免疫印跡法檢測果顯示三組細胞中caspase均無表達， Bcl-2在rMBL（1μg/ml）+IgA腎病血清組的系膜細胞中表達減弱，在正常血清組與IgA腎病血清組無明顯差別。
　　 13、與正常血清組及IgA腎病血清組相比，rMBL（1μg/ml）+IgA腎病血清組p65表達明顯增強。rMBL（1μg/ml）+IgA腎病血清組系膜細胞上清液中MCP-1、IL-6的蛋白濃度明顯高于IgA腎

16、病血清組和正常血清組，IgA腎病血清組也明顯高于正常血清組。
　　 結(jié)論：
　　 1、尿MBL水平能夠反映IgA腎病的嚴重程度，并與腎臟預(yù)后有關(guān)，因而可望成為判斷IgA腎病預(yù)后的可靠的生物標記物。
　　 2、存在腎小球MBL沉積的IgA腎病患者臨床及病理表現(xiàn)更為嚴重，腎臟的緩解率更低。腎小球MBL沉積可望成為判斷IgA腎病預(yù)后的一個重要的病理預(yù)測因子。
　　 3、MBL能夠抑制體外人腎系膜細胞的生長，促進