泥蚶大規(guī)模死亡的病原生物學及其宿主血細胞免疫特性研究.pdf

1、泥蚶是重要的養(yǎng)殖經(jīng)濟貝類，但近年來泥蚶病害問題日益突出，大規(guī)模死亡頻繁發(fā)生，造成較大損失。查明大規(guī)模死亡病因，加強泥蚶病害免疫預防研究，對促進泥蚶養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展、豐富貝類免疫學理論具有重要意義。本研究采用光鏡、電鏡、流式細胞儀、分子生物學、細胞生物學、生物信息學等技術，對樂清灣泥蚶大規(guī)模死亡原因進行了流行病學調(diào)查，并對泥蚶血細胞免疫特性以及血淋巴中免疫相關的天冬氨酸消旋酶基因進行了研究。
　　 1.2005年至2009年樂清灣養(yǎng)

2、殖泥蚶多次發(fā)生大量死亡。一種專性寄生于細胞內(nèi)的原核微生物，在瀕死和死亡的泥蚶中多次被檢測到。這些原核微生物通常呈圓形、橢圓形或啞鈴形;大小在0.28μm和0.71μm之間;為三層細胞膜結構;具有橫二分裂和出芽兩種繁殖方式。這種原核微生物能形成細胞內(nèi)嗜曙紅性的包涵體。這些包涵體主要分布于外套膜、鰓、消化管的上皮組織和結締組織中。根據(jù)生物學和形態(tài)學特點，推測該原核微生物屬于立克次氏體科，定名為類立克次氏體(RLO)。這種RLO表現(xiàn)出較強的致

3、病性。病理學檢查發(fā)現(xiàn)被RLO感染的細胞呈現(xiàn)嚴重的病理變化;組織的破壞程度與RLO包涵體的數(shù)量正相關;細胞病變程度與細胞內(nèi)RLO數(shù)量正相關;具有相似特征的RLO及其包涵體，在不同養(yǎng)殖場、不同發(fā)病時間所采集的泥蚶病樣中都有發(fā)現(xiàn);RLO感染強度與泥蚶死亡率正相關。為此，認為RLO感染與樂清灣養(yǎng)殖泥蚶大量死亡有密切聯(lián)系。
　　 2.根據(jù)細胞大小、形態(tài)結構、顆粒特點，光鏡下可將泥蚶血細胞區(qū)分為紅色顆粒細胞(占89.67％)、嗜堿性顆粒細胞

4、（占7.05％）、透明細胞（占3.28％）三種主要類型。健康泥蚶血淋巴中血細胞平均密度為3.29±0.82×106cell/mL。透射電鏡下觀察到顆粒細胞Ⅰ型、顆粒細胞Ⅱ型、無顆粒細胞;掃描電鏡觀察下，細胞表面光滑，部分細胞表面有小的突起物。用流式細胞儀檢測出P1(13.13％)和P2(78.83％)兩個細胞亞群以及沒有固定形態(tài)的細胞（近8％）。利用APIZYM試劑盒對健康泥蚶血細胞及血清中的19種酶進行檢測，在血細胞中檢測到11種酶，

5、在血清中檢測到了13種酶，經(jīng)酵母聚糖刺激后，堿性磷酸酶、酸性磷酸酶、類脂脂酶、N-乙酰葡萄糖胺酶在血細胞和血清中水平大幅升高。體外吞噬實驗揭示紅色顆粒細胞對酵母聚糖具有明顯的吞噬能力，嗜堿性顆粒細胞和透明細胞吞噬作用不顯著;在經(jīng)嗜水氣單胞桿菌刺激后，嗜堿性顆粒細胞出現(xiàn)大量聚集現(xiàn)象，透明細胞能吸附顆粒物。吞噬活性研究表明，溫度、鹽度對泥蚶血細胞的吞噬活性有顯著的影響，在泥蚶適宜生長溫度(13-30℃)區(qū)間和最適鹽度(20.0-26.2pp

6、t)區(qū)間，血細胞吞噬活性達到最高值。
　　 3.從泥蚶血細胞中克隆出天冬氨酸消旋酶(AR)基因，泥蚶AR基因的ORF序列全長1017bp，編碼338個氨基酸，預測蛋白分子量為37.1 kDa，理論等電點為8.62，為堿性蛋白。序列分析發(fā)現(xiàn)，泥蚶氨基酸序列與魁蚶AR氨基酸序列的同源性達到93％，與海膽和海鞘的AR氨基酸序列同源性為51％和41％。聚類分析表明，泥蚶AR能與所有已報道的生物AR聚合在一起，表明成功克隆了泥蚶天冬氨酸消