調(diào)控CXCR7蛋白表達(dá)對小鼠MSC增殖及遷移能力影響的研究.pdf

1、本文主要從以下幾個部分展開論述：
　　第一部分 慢病毒介導(dǎo)高表達(dá)及低表達(dá)CXCR7蛋白的間充質(zhì)干細(xì)胞株構(gòu)建及鑒定
　　目的:構(gòu)建慢病毒介導(dǎo)的穩(wěn)定高表達(dá)及低表達(dá)趨化因子受體7(CXCR7)蛋白的小鼠骨髓來源間充質(zhì)干細(xì)胞(mMSCs)細(xì)胞株。
　　方法:(1)貼壁法從C57BL/6小鼠原代分離mMSCs并鑒定表面標(biāo)記物及成脂、成骨、成軟骨能力;(2)分別將含有CXCR7基因及干擾基因的質(zhì)粒使用PCR、酶切、連接、轉(zhuǎn)化、挑取

2、克隆等方法進(jìn)行質(zhì)粒提取鑒定，隨后將病毒包裝、濃縮，轉(zhuǎn)染mMSCs細(xì)胞株;(3)分別將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞培養(yǎng)傳至第20代，熒光鏡檢及流式細(xì)胞法鑒定轉(zhuǎn)染效率，qRT-PCR法和流式細(xì)胞法分別檢測mMSCs的CXCR7 mRNA和蛋白表達(dá)水平。
　　結(jié)果:(1)分離純化后的mMSCs為成纖維細(xì)胞樣，流式細(xì)胞學(xué)鑒定表達(dá)CD29、CD34、CD44，不表達(dá)CD117，且可體外誘導(dǎo)分化為成脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞和成軟骨細(xì)胞。(2)慢病毒介導(dǎo)的高表達(dá)或低

3、表達(dá)CXCR7基因轉(zhuǎn)染mMSCs，傳代培養(yǎng)20代后，轉(zhuǎn)染效率仍高達(dá)91.28％-91.69％，高表達(dá)CXCR7基因的mMSCs的CXCR7 mRNA水平增加至5.7倍(P＜0.05)，蛋白水平增加至1.7倍(P＜0.05);而低表達(dá)CXCR7基因的mMSCs的CXCR7 mRNA水平降低至30％(P＜0.05)，蛋白水平降低至28％(P＜0.05)。
　　結(jié)論:慢病毒介導(dǎo)的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染成功構(gòu)建高表達(dá)及低表達(dá)CXCR7蛋白的mMSCs，

4、為進(jìn)一步研究奠定實驗基礎(chǔ)。
　　第二部分 調(diào)控CXCR7蛋白表達(dá)對mMSCs體外增殖及遷移影響的研究
　　目的:探索調(diào)控CXCR7蛋白表達(dá)后mMSCs的增殖及遷移能力變化并探討其可能的機(jī)制。
　　方法:使用高表達(dá)或低表達(dá)CXCR7蛋白的mMSCs，將實驗分為七組，分別為空白組（MSC-Blank組，Blank組）、高表達(dá)組（MSC-OE-CXCR7組，OE組）、高表達(dá)對照組（MSC-OENC-CXCR7組，OENC組）

5、、低表達(dá)組（MSC-Sh-CXCR7組，Sh組）、低表達(dá)對照組（MSC-ShNC-CXCR7組，ShNC組）、高表達(dá)藥物干擾組（MSC-OE-CXCR7+CXCL12組，OE加藥組）、低表達(dá)藥物干擾組（MSC-Sh-CXCR7+CXCL12組，Sh加藥組）。對于前五組使用細(xì)胞計數(shù)法檢測增殖水平，并通過劃痕檢測其水平遷移能力。通過Tranwell小室實驗，在OE加藥組及Sh加藥組的小室下腔加入重組CXCL1250ng/ml干預(yù)，分別檢測七

6、組細(xì)胞的侵襲能力，并收集七組細(xì)胞上清液及細(xì)胞裂解液。通過ELISA發(fā)檢測細(xì)胞上清液中血管細(xì)胞黏附因子-1(VCAM-1)、基質(zhì)細(xì)胞衍生因子(SDF-1，即CXCL12)、重組人膠原蛋白(Collagen-Ⅰ)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素-10(IL-10)及細(xì)胞裂解液中趨化因子受體4(CXCR4)的濃度。
　　結(jié)果:(1)高表達(dá)CXCR7提高mMSCs的增殖能力，而低表達(dá)CXCR7降低mMSCs的增殖能力:與OENC組

7、相比，OE組自第3天至第7天增殖能力顯著增強(qiáng)(P＜0.001)，與ShNC組相比，Sh組自第5天至第7天增殖能力顯著減弱(P＜0.05)。
　　(2)高表達(dá)CXCR7提高mMSCs的遷移能力，而低表達(dá)CXCR7降低mMSCs的遷移能力:劃痕18h后OE組劃痕修復(fù)較OENC組明顯增加(P＜0.05)，而Sh組較ShNC組劃痕修復(fù)明顯減少(P＜0.05); Transwell實驗12h后，與OENC組相比，OE組和OE加藥組細(xì)胞遷移明

8、顯增多(P＜0.05)，且與OE組相比，OE加藥組的細(xì)胞遷移顯著增加(P＜0.05);與ShNC組相比，Sh組細(xì)胞遷移明顯減少(P＜0.05)，且與Sh組相比，Sh加藥組細(xì)胞遷移顯著增加(P＜0.05)。
　　(3)高表達(dá)CXCR7提高mMSCs的血管粘附能力，而低表達(dá)CXCR7降低mMSCs的血管粘附能力:與OENC組相比，OE組和OE加藥組VCAM-1的濃度顯著增加（P＜0.05），且與OE組相比，OE加藥組VCAM-1的濃度

9、亦顯著增加(P＜0.001);與 ShNC組相比，Sh組VCAM-1的濃度顯著減少(P＜0.05)，而Sh加藥組VCAM-1濃度顯著增加(P＜0.05)。與此同時，與MSC-Sh-CXCR7組相比，Sh加藥組VCAM-1濃度顯著增加(P＜0.05)。
　　(4)高表達(dá)CXCR7提高mMSCs的分泌CXCL12能力，而低表達(dá)CXCR7降低mMSCs的分泌CXCL12能力:與OENC組相比，OE組和OE加藥組CXCL12的濃度顯著增加

10、(P＜0.001)，且與OE組相比，OE加藥組CXCL12的濃度亦顯著增加(P＜0.05);與ShNC組相比，Sh組CXCL12的濃度顯著減少(P＜0.05)。
　　(5)高表達(dá)CXCR7可減少mMSCs表面CXCR4的表達(dá):通過ELISA法顯示，與OENC組相比，OE組和OE加藥組CXCR4的濃度顯著減少(P＜0.05)。
　　結(jié)論:高表達(dá)CXCR7蛋白提高mMSCs的增殖及遷移能力，低表達(dá)CXCR7蛋白降低mMSCs的增