人字草抗炎物質(zhì)基礎(chǔ)及其總黃酮提取物的研究.pdf

1、人字草(Kummerowia striata(Thunb)Schindl.)學(xué)名雞眼草,是豆科(Legumlnosae)雞眼草屬(Kummerowia Schindl.)一年生草本植物。在我國很多地區(qū),民間常用人字草治療炎癥相關(guān)疾病,但未見有關(guān)其抗炎活性物質(zhì)和藥材質(zhì)量等方面的研究?；诖?本研究對(duì)人字草抗炎物質(zhì)基礎(chǔ)、藥材質(zhì)量進(jìn)行了較為系統(tǒng)地研究,并對(duì)人字草抗炎活性物質(zhì)的制備工藝及初步藥效學(xué)進(jìn)行了探討,為揭示民間植物藥人字草的抗炎作用機(jī)理

2、提供了理論與技術(shù)基礎(chǔ),為其藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制訂、藥物制劑的研究與臨床應(yīng)用提供了一定的科學(xué)依據(jù)。
　　 系統(tǒng)檢索了國內(nèi)外有關(guān)人字草的生藥學(xué)、化學(xué)成分、藥理和臨床研究方面的文獻(xiàn),完成了文獻(xiàn)綜述。
　　 建立了脂多糖(LPS)誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞系RAW264.7細(xì)胞體外炎癥模型,使用不同濃度的人字草乙醇提取物對(duì)其進(jìn)行干預(yù);ELIsA法檢測藥物干預(yù)前后上清液中TNF-α、IL-1β和IL-6的分泌量,Griess反應(yīng)測定NO水平;實(shí)時(shí)熒

3、光定量RT-PCR檢測TNF-α、iNOS和COX-2的mRNA表達(dá);Westernblot法檢測COX-2和HO-1的蛋白表達(dá)水平。結(jié)果表明,人字草乙醇提取物具有類似地塞米松的抗炎作用,它可以通過下調(diào)TNF-α、IL-1β、IL-6、NO和COX-2等炎癥介質(zhì)的表達(dá),同時(shí)促進(jìn)HO-1的釋放而發(fā)揮一定的抗炎作用。
　　 采用系統(tǒng)溶劑法將人字草乙醇提取物制備成環(huán)己烷、乙酸乙酯、正丁醇、水4個(gè)溶劑部位,采用二甲苯致小鼠耳腫脹模型觀察

4、人字草各部位抗炎作用。研究結(jié)果表明,乙酸乙酯部位高低劑量均能明顯減輕小鼠耳腫脹,顯示良好的抗炎作用。進(jìn)一步對(duì)乙酸乙酯抗炎活性部位進(jìn)行化學(xué)成分研究,從中分離鑒定出9個(gè)化合物:β-谷甾醇(β-sitosterol,Ⅰ)、芹菜素(Apigenin,Ⅱ)、山奈酚(Kaempferol,Ⅲ)、槲皮素(Qlaercetin,Ⅵ)、異槲皮苷(Isoquercitrin,Ⅶ)、蘆丁(Rutin,Ⅷ)、木犀草苷(Luteoloside,Ⅹ)、異牡荊素(I

5、sovitexin,Ⅺ)和異葒草素(Isoorientin,Ⅻ)。其中除芹菜素和槲皮素外,其他7個(gè)化合物均為首次從該植物中發(fā)現(xiàn)。
　　 以槲皮素和木犀草素為對(duì)照品,對(duì)人字草藥材進(jìn)行了定性鑒別研究,建立了專屬性鑒別方法。以蘆丁為對(duì)照品,在510nm波長處采用紫外分光光度法測定人字草和同屬長萼雞眼草中總黃酮的含量。采用反相高效液相法對(duì)人字草水解產(chǎn)物中的槲皮素和木犀草素的含量進(jìn)行了測定,色譜柱為ZorbaxSB-C18柱(4.6mm×

6、250mm,5μm),流動(dòng)相為甲醇-0.2％磷酸(50:50),檢測波長360nm,柱溫30℃,流速1.0mL/min。此外,還對(duì)人字草中的異葒草素含量進(jìn)行了測定,色譜柱為Welchrom.c18柱(4.6mm×250mm,5μm),流動(dòng)相為乙腈-0.2%磷酸(15:85),檢測波長360nm,柱溫30℃,流速1.0mL/min。結(jié)果表明,人字草中總黃酮的含量約3.32%,槲皮素和木犀草素的含量分別為0.233%和0.032%,槲皮素在

7、5.28.26.4μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,r=0.9995(n=5),木犀草素在4.12-20.6μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,r=0.9991(n=5);異葒草素的含量為0.305%,異葒草素在8.08～40.4μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,r=0.9999(n=5)。不同采收時(shí)間樣品中總黃酮含量比較結(jié)果顯示,藥材比較合適的采收時(shí)間是8月至9月上旬,這些為藥材的合理采收和質(zhì)量控制提供了科學(xué)依據(jù)。
　　 在此基礎(chǔ)上,通過正

8、交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和單因素比較,優(yōu)選了人字草的抗炎有效部位群總黃酮的提取工藝、澄清工藝和純化工藝——藥材用15倍的70%的乙醇回流提取2次,每次1小時(shí),過濾,合并兩次提取的過濾液;將過濾液濃縮至藥材重量與濃縮液體積比為1:6,在60℃水浴條件下,攪拌下加入1.0%的殼聚糖醋酸溶液至含量為0.60%(即100克人字草藥材需加入0.60克的殼聚糖),常溫靜置24小時(shí)后濾過;然后采用D-101型非極性大孔吸附樹脂,樹脂徑高比為1:8,上樣量為4倍BV

9、的人字草溶液(6.0mg/mL),上樣速度2.0mL/min,2倍BV水沖洗后,用4倍BV的80%乙醇進(jìn)行洗脫,洗脫速度3.0mL/min,洗脫液減壓濃縮,干燥,粉碎,即得人字草總黃酮提取物。
　　 參照人字草藥材質(zhì)量研究的方法,對(duì)人字草總黃酮提取物進(jìn)行質(zhì)量控制研究,測定了其總黃酮、木犀草素的含量,并進(jìn)行定性鑒別研究,結(jié)果所制人字草總黃酮提取物的總黃酮含量在60%左右,木犀草素的含量在2.4%左右。
　　 采用二甲苯致小