衛(wèi)矛抗炎物質(zhì)基礎(chǔ)及其質(zhì)量控制研究.pdf

1、目的:
　　本文的目的旨在系統(tǒng)開展中藥衛(wèi)矛抗炎物質(zhì)基礎(chǔ)、質(zhì)量控制方法等相關(guān)的藥學(xué)基礎(chǔ)研究，為明確中藥衛(wèi)矛的抗炎物質(zhì)基礎(chǔ)、保障藥材質(zhì)量穩(wěn)定可控奠定基礎(chǔ)，也為中藥衛(wèi)矛的二次開發(fā)提供理論支持。
　　方法:
　　1、衛(wèi)矛抗炎活性部位篩選
　　將衛(wèi)矛藥材用75％乙醇溶液加熱回流浸提，浸提液進(jìn)行減壓濃縮到無醇味，得到的衛(wèi)矛總樣，依次予以不同極性溶劑萃取，包括石油醚、乙酸乙酯、水飽和正丁醇三種試劑，相同體積(V/V=1∶1)萃

2、取3次，獲得3個極性部位萃取液（分別為石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位）。
　　采用MTT法檢測衛(wèi)矛3個部位粗提物及乙醇浸膏總提物作用于RAW264.7巨噬細(xì)胞24小時對其生長的影響，篩選各部位安全濃度范圍;選用LPS（1μg/mL）刺激RAW264.7巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞炎癥模型作為受試對象，采用Griess法檢測衛(wèi)矛不同部位（安全濃度范圍內(nèi)選取3-4個濃度）作用于RAW264.7巨噬細(xì)胞24小時后，對其釋放NO量造成的影響。

3、
　　2、衛(wèi)矛抗炎有效部位的化學(xué)成分研究
　　針對篩選得到的抗炎活性較強(qiáng)的乙酸乙酯部位和石油醚部位分別進(jìn)行硅膠柱色譜分離，依次予以不同比例三氯甲烷、甲醇溶劑系統(tǒng)按梯度洗脫，對各洗脫部位的化學(xué)成分進(jìn)行系統(tǒng)的研究，通過硅膠柱，大孔樹脂，ODS，Sephadex LH-20，TLC制備薄層等色譜技術(shù)進(jìn)行分離，利用現(xiàn)代光譜學(xué)技術(shù)(ESI-MS、1H-NMR、13C-NMR、2D-NMR)進(jìn)行化合物結(jié)構(gòu)鑒定。
　　3、衛(wèi)矛化合物

4、抗炎活性評價
　　基于上述相同受試細(xì)胞和細(xì)胞模型，采用MTT法檢測衛(wèi)矛化合物作用于RAW264.7巨噬細(xì)胞24小時對其生長的影響，篩選安全濃度范圍。Griess法檢測LPS(1μg/mL)和衛(wèi)矛化合物（安全濃度范圍內(nèi)）共同作用于RAW264.7巨噬細(xì)胞24小時對其分泌NO的影響。
　　4、基于UHPLC-LTQ-Orbitrap MSn技術(shù)的衛(wèi)矛化學(xué)成分的快速識別與鑒定
　　采用黃酮類代表化合物以及酚酸類化合物直接持續(xù)

5、進(jìn)樣方式，進(jìn)樣速度為3μL/min。質(zhì)譜全掃描范圍為m/z150-1500，高分辨全掃描分辨率設(shè)為30000，MS2-MS3采用Orbitrap高分辨掃描，掃描分辨率設(shè)為15000，MS4以后的子離子則全部采用LTQ打拿極(dynote)檢測。選擇上一級最高峰進(jìn)行下級碎裂掃描，碎裂方式為碰撞誘導(dǎo)解離(CID)方式，其碰撞能量為35％，選擇峰寬范圍為m/z±1。以特征離子信號和多級質(zhì)譜數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，輔以高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)并結(jié)合文獻(xiàn)證實(shí)，推測代表

6、性衛(wèi)矛黃酮類及酚酸化合物在負(fù)離子模式下可能的裂解規(guī)律。
　　建立衛(wèi)矛化學(xué)成分質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫，并運(yùn)用UHPLC-LTQ-Orbitrap MSn技術(shù)，結(jié)合模式成分的質(zhì)譜裂解規(guī)律，對衛(wèi)矛藥材化學(xué)成分進(jìn)行分析。色譜柱采用Thermo HypersilGold C18 column，流動相由乙腈(A)和含0.1％甲酸水(B)兩相組成，梯度洗脫，液相條件為:5％A(0min);15％A(6min)，15％A(12min);38％A(25min)

7、;70％A(30min)和90％A(35min);90％A(40min)，流速為300μL/min，在線DAD檢測200-400nm范圍光譜。質(zhì)譜條件為:選用電噴霧離子源(ESI)與液相部分連接，采用負(fù)離子檢測模式采集，掃描范圍為m/z150-1500，離子源所用氣體為氮?dú)?，毛?xì)管溫度為300，噴霧電壓為3.8kV，毛細(xì)管電壓-18kV。一級全掃描采用高分辨設(shè)置，其分辨率設(shè)置為30000，二級質(zhì)譜高分辨全掃描分辨率設(shè)為15000，三級質(zhì)

8、譜高分辨全掃描設(shè)置為7500。多級掃描采用數(shù)據(jù)依賴性掃描，選取上一級最高豐度母離子進(jìn)行碎裂并進(jìn)行動態(tài)排除設(shè)置。
　　5、基于UHPLC-ESI-MS/MS技術(shù)的衛(wèi)矛11種抗炎活性成分的含量測定
　　運(yùn)用TSQ Quantum Ultra三重四級桿質(zhì)譜電噴霧(ESI)離子源技術(shù)建立快速測定衛(wèi)矛11種代表性成分阿魏酸、香草酸、綠原酸、咖啡酸、槲皮素、柚皮素、香橙素、橙皮苷、山奈酚、金絲桃苷、去氫雙兒茶精A含量的方法，并對40批不

9、同產(chǎn)地、不同來源的中藥衛(wèi)矛飲片進(jìn)行檢測。采用Thermo fisher Accela UHPLC超高壓色譜系統(tǒng)。系統(tǒng)程序?yàn)?液相色譜柱為Waters UHPLC BEH C18柱(2.1mm×50mm,1.7μm)。流動相為乙腈(A)和0.1％甲酸水系統(tǒng)組成，分析時間10min，梯度洗脫。液相條件為:5％A(0min),25％A(3.5min),90％A(7.5min),95％A(8.5min)和95％A(10 min)，每次進(jìn)樣前以初

10、速流動相平衡4min。流速為300μL/min，柱溫為室溫。進(jìn)樣量為5μL，在線DAD檢測記錄200-400nm光譜數(shù)據(jù)。
　　6、基于UHPLC-ESI-MS/MS技術(shù)的衛(wèi)矛11種抗炎活性成分的大鼠灌胃衛(wèi)矛提取藥液后血藥濃度監(jiān)測
　　SD雄性大鼠SPF級動物房室溫環(huán)境下適應(yīng)性飼養(yǎng)一周。實(shí)驗(yàn)組及空白組均按0.8mL/100 g劑量分別灌胃給予衛(wèi)矛提取液或生理鹽水。并于給藥后5、10、15、20、30、45、60、120、24

11、0、480、720min大鼠眼眶靜脈叢取血750μL至1.5mLEP管內(nèi)。所得血樣于3h內(nèi)經(jīng)4℃低速離心(5000rpm，10min)，取上層血漿，-80℃保存。
　　色譜柱采用Waters UHPLC BEH C18(2.1mm×100mm，1.7μm)。流動相為乙腈(A)和0.1％甲酸水系統(tǒng)組成，梯度洗脫。系統(tǒng)程序?yàn)?8％A(0min)、30％A(3.5min)、85％A(7.5min)、90％A(8.5min)、90％A(1

12、0min)。流速為300μL/min。柱溫為室溫。進(jìn)樣量為5μL。質(zhì)譜方法采用ESI離子源。定量檢測采用多反應(yīng)離子檢測(MRM)模式，進(jìn)行正負(fù)離子同時檢測，其離子對選擇如下:阿魏酸:m/z169→125;香草酸:m/z167→152;綠原酸:m/z353→191;咖啡酸:m/z179→135;槲皮素:m/z301→151;柚皮素:m/z273→153;香橙素:m/z287→259;橙皮苷:m/z609→301;山奈酚:m/z285→18

13、5;金絲桃苷:m/z463→300;去氫雙兒茶精A:m/z675→271。內(nèi)標(biāo)選擇氯雷他定:m/z383→267。
　　結(jié)果:
　　1、衛(wèi)矛乙醇提取物具有一定的抗炎活性，其中石油醚部位為浸膏產(chǎn)率最高部位，而三個不同極性部位均展現(xiàn)出強(qiáng)于總提部位的抗炎活性。
　　2、篩選得到的衛(wèi)矛分離純化得到23個化合物，鑒定了21個化合物結(jié)構(gòu).
　　3、衛(wèi)矛化合物1、3、5、6、7、8、9、12、15、17能抑制RAW264.7巨

14、噬細(xì)胞分泌NO，其中化合物豆甾烷-3-酮和kaempferol-7-methyl ether活性最強(qiáng)，在濃度為10μg/mL時就表現(xiàn)可以比擬甚至超于陽性藥物地塞米松對于NO的釋放抑制率影響。
　　4、運(yùn)用LTQ-Orbitrap高分辨多級質(zhì)譜技術(shù)系統(tǒng)研究了衛(wèi)矛8個主要黃酮類成分和4個酚酸類成分的質(zhì)譜裂解規(guī)律。對其關(guān)鍵的離子碎裂位置進(jìn)行了分析與模擬，首次全面分析了橙皮苷、山奈酚、香橙素、槲皮素、金絲桃苷、柚皮素、兒茶素、去氫雙兒茶精

15、A、阿魏酸、香草酸，綠原酸和咖啡酸在質(zhì)譜中的裂解行為，為研究衛(wèi)矛相關(guān)黃酮類及酚酸類衍生物的定性檢測提供依據(jù)。
　　5、運(yùn)用于40批不同產(chǎn)地的中藥衛(wèi)矛飲片的檢測，結(jié)果表明該方法用于定量方法開發(fā)具有快速靈敏的優(yōu)點(diǎn)，可用于衛(wèi)矛及其相關(guān)制品的質(zhì)量控制;研究結(jié)果同時表明40批衛(wèi)矛藥材采收自各地的含量測定結(jié)果表明:衛(wèi)矛藥材中11種被測成分的總含量變化為0μg/g-631.04μg/g，表明不同產(chǎn)地的衛(wèi)矛藥材含量顯著不同。在40批衛(wèi)矛藥材中，采

16、購于北京同仁堂和產(chǎn)地江西的衛(wèi)矛藥材比之其他產(chǎn)地藥材11種代表化合物含量均較高，推測質(zhì)量相對較好，且歸為一類（Ⅲ類）;河北、湖北、云南、浙江產(chǎn)地的衛(wèi)矛藥材，幾乎檢測不到綠原酸成分，且黃酮類成分總含量也較少（Ⅰ類）。同時柚皮素（平均含量136.68μg/g）是衛(wèi)矛藥材11種待測成分中含量最高的成分。
　　6、采用MRM模式建立了11種指標(biāo)成分的體內(nèi)定量檢測方法，血漿中香草酸、咖啡酸、阿魏酸、山奈酚、槲皮素、綠原酸、金絲桃苷、橙皮苷、柚

17、皮素、去氫雙兒茶精A、香橙素11種待測成分在體內(nèi)吸收均較迅速，但是上述成分在大鼠體內(nèi)的藥時曲線卻有所差異。從11種待測成分的最大濃度時間點(diǎn)可以看出，香草酸、阿魏酸和咖啡酸速度最快，為15-20min左右;山奈酚、橙皮苷、柚皮素、綠原酸、槲皮素和香橙素相對較快，為45min-1h左右;金絲桃苷和去氫雙兒茶精A相對最慢，于給藥后2h達(dá)到血漿峰濃度。結(jié)果表明此方法具有去干擾能力強(qiáng)、檢測靈敏度高、快速簡便的優(yōu)點(diǎn)，通過三重四級桿定量研究中藥復(fù)雜體

18、系中多個指標(biāo)成分的藥代動力學(xué)具有一定的優(yōu)勢。
　　結(jié)論:
　　本文以中藥衛(wèi)矛為研究對象，引入轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)的科研思想，針對中藥衛(wèi)矛臨床治療各類炎癥頻繁而抗炎活性物質(zhì)基礎(chǔ)研究不夠系統(tǒng)與深入的局面，開展衛(wèi)矛的化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)、抗炎物質(zhì)基礎(chǔ)研究，并以篩選得到抗炎活性物質(zhì)作為研究熱點(diǎn)，建立與之配套的質(zhì)控方法，同時從入血角度出發(fā)，對代表性抗炎活性成分進(jìn)行血藥濃度變化監(jiān)測，為闡明中藥衛(wèi)矛的抗炎活性物質(zhì)基礎(chǔ)及體內(nèi)外成分的在線快速檢測提供方法學(xué)借鑒，