代謝型谷氨酸受體6在黑素細胞形態(tài)及黑素小體轉(zhuǎn)運中的作用研究.pdf

1、目的:
　　探討代謝型谷氨酸受體6(metabotropic glutamate receptor6，mGluR6)對黑素細胞形態(tài)影響及其在黑素細胞-角質(zhì)形成細胞共培養(yǎng)體系中對黑素轉(zhuǎn)運的作用及其相關機制。
　　方法:
　　1.原代培養(yǎng)純化黑素細胞，合成慢病毒載體Lv-mGluR6-shRNA，對黑素細胞進行轉(zhuǎn)染并敲除mGluR6表達。
　　2.免疫印跡法（Western blotting）檢測慢病毒轉(zhuǎn)染后mGlu

2、R6的表達情況。
　　3.掃描電鏡觀察Lv-mGluR6-shRNA轉(zhuǎn)染后黑素細胞的偽足及樹突形態(tài)變化。
　　4.建立體外黑素細胞與HaCat角質(zhì)形成細胞共培養(yǎng)體系。掃描電鏡觀察Lv-mGluR6-shRNA轉(zhuǎn)染后共培養(yǎng)體系中絲狀偽足連接的變化;NaOH法測定共培養(yǎng)體系中角質(zhì)形成細胞中的黑素含量;運用免疫熒光雙染色，流式細胞術檢測黑素小體轉(zhuǎn)運效率。
　　5.免疫熒光染色，激光共聚焦顯微鏡下觀察Lv-mGluR6-shR

3、NA轉(zhuǎn)染后細胞骨架蛋白β-tublin的分布變化和共培養(yǎng)體系下黑素細胞在角質(zhì)形成細胞中分布含量的區(qū)別。
　　結(jié)果:
　　1.掃描電鏡發(fā)現(xiàn)黑素細胞在慢病毒轉(zhuǎn)染后，樹突變短，二、三級樹突數(shù)量減少，細胞表面?zhèn)巫銛?shù)目明顯減少。
　　2.黑素細胞與角質(zhì)形成細胞的共培養(yǎng)體系中，兩細胞間以絲狀偽足相連，轉(zhuǎn)染后的共培養(yǎng)體系中，相連接的絲狀偽足數(shù)量明顯減少。
　　3.共培養(yǎng)48小時后，NaOH法測定轉(zhuǎn)染組角質(zhì)形成細胞中黑素含量明顯

4、少于對照組。
　　4.使用NKI/beteb抗體標記黑素小體、廣譜細胞角蛋白抗體標記角質(zhì)形成細胞，激光共聚焦顯微鏡觀察角質(zhì)形成細胞中分布黑素小體。與對照組相比，慢病毒轉(zhuǎn)染后角質(zhì)形成細胞中的黑素小體數(shù)目明顯減少;流式細胞術檢測顯示黑素小體在角質(zhì)形成細胞中的含量隨時間遞增，與對照組相比，轉(zhuǎn)染組轉(zhuǎn)運效率明顯下降。
　　5.激光共聚焦顯微鏡觀察β-tublin抗體標記的細胞骨架蛋白在轉(zhuǎn)染組和對照組有明顯差異;轉(zhuǎn)染組骨架蛋白呈點狀分布

5、，不呈網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)相連接;對照組骨架蛋白成管束狀分布均勻。
　　結(jié)論:
　　1.mGluR6的表達與黑素細胞骨架蛋白分布及黑素細胞形態(tài)密切相關。
　　2.mGluR6的表達與共培養(yǎng)體系中絲狀偽足的形成有關。
　　3.mGluR6的表達影響共培養(yǎng)體系中黑素小體的轉(zhuǎn)運。
　　4.mGluR6的表達影響黑素小體的轉(zhuǎn)運，其可能機制為:(1)通過改變黑素細胞骨架蛋白分布和形態(tài)影響黑素小體轉(zhuǎn)運。(2)通過改變共培養(yǎng)體系中絲