谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白載體的構(gòu)建及鑒定.pdf_第1頁
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1、谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白也稱興奮性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(Excitatory amino acid transporter,EAAT)主要存在于神經(jīng)細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞漿膜上,EAAT轉(zhuǎn)運(yùn)谷氨酸是離子依賴的耗能過程。目前認(rèn)為,細(xì)胞外沒有使谷氨酸代謝失活的酶,而使谷氨酸在神經(jīng)系統(tǒng)滅活的唯一途徑是通過神經(jīng)細(xì)胞的再攝取和吸收,其中起主要作用的是位于神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞上的EAAT2和位于神經(jīng)元上的EAAT3。本課題擬構(gòu)建EAAT2和EAAT3的表達(dá)載體,為與EAAT2

2、和EAAT3減少的相關(guān)中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病提供一定的基礎(chǔ)。
  實(shí)驗(yàn)一重組腺病毒EAAT2的構(gòu)建及鑒定
  目的:利用基因克隆技術(shù)克隆EAAT2基因全長(zhǎng)cDNA,并構(gòu)建及鑒定其重組腺病毒載體。
  方法:從大鼠腦組織中用RT-PCR方法得到EAAT2的基因全長(zhǎng)片斷,將其導(dǎo)入T載體進(jìn)行測(cè)序,得到準(zhǔn)確的序列后再導(dǎo)入腺病毒穿梭質(zhì)粒當(dāng)中。將穿梭質(zhì)粒和病毒骨架通過電穿孔導(dǎo)入細(xì)菌內(nèi)進(jìn)行重組,挑選陽性克隆,提取重組后的質(zhì)粒,用脂質(zhì)體法將

3、其在體外轉(zhuǎn)染入HEK293細(xì)胞,并在細(xì)胞內(nèi)部包裝。用倍比稀釋感染法測(cè)定腺病毒的滴度。
  結(jié)果:成功將EAAT2連入帶有綠色熒光的腺病毒載體中,病毒滴度為2×108pfu/ml。
  結(jié)論:成功構(gòu)建了pAd/EAAT2載體,為EAAT2缺乏的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療和研究奠定了基礎(chǔ)。
  實(shí)驗(yàn)二大鼠EAAT3真核表達(dá)載體的構(gòu)建和在Hella細(xì)胞中的表達(dá)
  目的:克隆大鼠谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白3(EAAT3)的cDNA,構(gòu)

4、建其真核表達(dá)載體并轉(zhuǎn)染Hella細(xì)胞。
  方法:從大鼠的腦組織中提取RNA,采用RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增EAAT3的基因編碼區(qū)序列,將序列定向克隆至真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)。經(jīng)酶切及測(cè)序鑒定后用陽離子脂質(zhì)體將其轉(zhuǎn)染到Hella細(xì)胞中,通過免疫印跡法鑒定其表達(dá)。
  結(jié)果:經(jīng)雙酶切、測(cè)序鑒定證實(shí)EAAT3基因的真核表達(dá)載體構(gòu)建成功。免疫印跡法證實(shí)EAAT3基因的表達(dá)。
  結(jié)論:成功克隆了EAAT3編碼區(qū)序列,并

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