MiR-214與腺苷A2A受體相互調(diào)控的分子機制及其在炎癥反應(yīng)中的作用研究.pdf

1、炎癥(inflammation)是具有血管系統(tǒng)的機體對損傷因子所發(fā)生的一系列復(fù)雜的防御反應(yīng)，具有殺滅病原體、限制感染及修復(fù)損傷等作用，是損傷、抗損傷和修復(fù)三為一體的統(tǒng)一過程。炎癥是伴隨多種疾病狀態(tài)下一種共有的復(fù)雜的病理現(xiàn)象，體表的外傷感染和各器官的大部分常見病和多發(fā)?。ㄈ绶窝住⒏窝?、腎炎等）都屬于炎癥性疾病。炎癥的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸取決于體內(nèi)各種促炎因素及抗炎因素在不同的環(huán)節(jié)、時相和過程相互作用和博弈時形成的復(fù)雜而又精細的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)是否平衡

2、。
　　微小RNA(microRNA，miRNA)已被證實在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。和其他分子類似，miRNA也有抑炎和促炎之分。其中的miR-214，目前研究提示主要發(fā)揮促炎作用，其機制為延緩單核細胞的凋亡及維持T細胞的活化，但miR-214能否通過直接抑制某些抑炎基因的表達來實現(xiàn)促炎尚無文獻報道。近年的研究表明，腺苷A2A受體(A2AR)活化后在外周組織通過抑制促炎細胞因子的產(chǎn)生和釋放、中性粒細胞浸潤等在多種器官組織損傷

3、和炎癥模型（如缺血性肝損傷、急性肺損傷、缺血再灌注損傷及急性腎損傷模型）中發(fā)揮顯著的抑制炎癥保護作用，但A2AR的蛋白表達水平卻在上述模型中表達下調(diào)，這無疑制約了A2AR激動劑的應(yīng)用。目前對A2AR自身表達調(diào)控對其抑炎作用的影響尚不清楚。
　　鑒于miR-214和A2AR在炎癥中均具有重要作用，那么A2AR的表達是否受到miR-214的調(diào)控？miRNA的加工和合成同樣受到其他分子的調(diào)控，A2AR的抑炎效應(yīng)是否包括抑制miR-214

4、的表達？以上目前均未有相關(guān)報道。為了明確miR-214與A2AR之間在炎癥中相互表達調(diào)控的作用機制及在炎癥中的作用:在本課題中，我們首先使用生物信息學(xué)預(yù)測，篩選出miR-214為研究對象，在小鼠巨噬細胞系RAW264.7細胞中，借助miR-214 mimic觀察對A2AR蛋白和mRNA表達的影響，然后利用報告基因分析解析A2AR基因3'端非編碼區(qū)(3'-UTR)與miR-214的結(jié)合位點。然后，我們猜測A2AR反過來也可能調(diào)控miR-2

5、14的表達，使用A2AR的激動劑CGS21680和拮抗劑ZM241385、PKA抑制劑H89和NF-κB抑制劑BAY11-7082處理小鼠骨髓來源的巨噬細胞(BMDMs)和RAW264.7細胞，觀察對miR-214表達的影響，探討了可能涉及的主要信號通路。最后，在BMDMs中過表達miR-214檢測對炎癥因子TNF-α和IL-6表達的影響，借助脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的小鼠急性肺損傷(ALI)模型，觀察A2AR蛋白和miR-214的表達相關(guān)

6、性以及聯(lián)合應(yīng)用A2AR激動劑和miR-214抑制劑對小鼠ALI模型傷情的影響。
　　主要取得了以下研究結(jié)果:
　　1.利用TargetScan、miRanda和miRmap生物信息學(xué)在線軟件預(yù)測可能調(diào)控A2AR的miRNA，發(fā)現(xiàn)在3'-UTR有miR-214潛在的結(jié)合位點;在RAW264.7細胞中，借助miR-214 mimic過表達miR-214，Western blot和Real-time PCR證實，miR-214可以

7、在蛋白水平而不是mRNA水平抑制A2AR的表達;構(gòu)建含A2AR3'-UTR的報告基因載體，使用雙熒光素酶報告基因檢測結(jié)合定點突變，詳細解析了A2AR3'-UTR與miR-214結(jié)合的精確位點;進行功能回復(fù)實驗，向轉(zhuǎn)染了mimic的細胞中同時轉(zhuǎn)染不含3'-UTR的A2AR真核表達質(zhì)粒，進一步確定miR-214是通過與A2AR3'-UTR的特異性結(jié)合來調(diào)控其表達。以上結(jié)果提示A2AR是miR-214的另一靶基因。
　　2.生物信息學(xué)預(yù)

8、測在miR-214啟動子區(qū)-1000～+200存在兩個轉(zhuǎn)錄因子NF-κB可能的結(jié)合位點;據(jù)此構(gòu)建了包含不同長度的miR-214啟動子區(qū)Luc報告基因載體并結(jié)合定點突變， Luc報告基因檢測顯示NF-κB的激活能夠促進miR-214啟動子的轉(zhuǎn)錄活性;結(jié)合染色質(zhì)免疫沉淀(ChIP)實驗證實NF-κB的p65亞基特異性的與miR-214啟動子區(qū)-490～-481和-27～-16結(jié)合。
　　在RAW264.7細胞中，借助A2AR激動劑和拮

9、抗劑，PKA和NF-κB抑制劑，經(jīng)Western blot檢測，A2AR活化后通過PKA途徑抑制IκBα的磷酸化進而抑制NF-κB p65亞基的核轉(zhuǎn)位從而抑制NF-κB通路;在BMDMs和RAW264.7中證實激活A(yù)2AR后通過PKA-NF-κB途徑下調(diào)miR-214表達，經(jīng)EMSA和ChIP-qPCR證實可能的機制是A2AR的活化使NF-κB p65的核轉(zhuǎn)位受到抑制，減弱其與miR-214啟動子區(qū)的結(jié)合從而降低了轉(zhuǎn)錄活性。以上結(jié)果闡明

10、了A2AR下調(diào)miR-214表達的分子機制，綜合1中結(jié)果，初步提示在細胞炎癥模型中存在miR-214/A2AR負反饋調(diào)控環(huán)路。
　　3.通過在BMDMs中轉(zhuǎn)染miR-214 agomir和LPS處理，構(gòu)建了miR-214過表達的細胞炎癥模型，借助Real-time PCR和ELISA方法檢測miR-214過表達促進了TNF-α和IL-6的表達;成功構(gòu)建LPS誘導(dǎo)的ALI模型，觀察到此炎癥模型中miR-214的表達顯著上調(diào)，而A2A

11、R蛋白的表達水平顯著降低，二者呈負相關(guān)關(guān)系;在此模型中聯(lián)合應(yīng)用A2AR激動劑及miR-214 antagomir治療損傷小鼠，通過HE染色、免疫組織化學(xué)和Real-time PCR的方法證實聯(lián)合應(yīng)用治療效果優(yōu)于單獨作用。通過上述細胞及動物實驗證實:miR-214具有促炎作用，綜合使用激活A(yù)2AR和抑制miR-214表達的方法更有益于控制炎癥反應(yīng)。
　　以上的研究成果表明，miR-214/A2AR負反饋調(diào)控環(huán)路在炎癥模型中具有促炎作