Toll樣受體2-4在高氧所致急性肺損傷炎癥反應(yīng)中的作用及其機(jī)制的研究.pdf

1、第一部分、高氧所致大鼠急性肺損傷Toll樣受體2、4的變化
　　 目的：探討Toll樣受體（TLRs）在高氧所致急性肺損傷發(fā)病過(guò)程中的變化及作用。
　　 方法：將24只SD大鼠置于氧體積分?jǐn)?shù)大于95％的密閉氧倉(cāng)中，分別于氧氣暴露24、48、72h，8只呼吸正?？諝獾腟D大鼠作為對(duì)照組，活殺各組大鼠，取肺組織標(biāo)本，測(cè)定肺濕/干重（W/D）比值以及肺組織形態(tài)學(xué)改變。用實(shí)時(shí)定量（real-time）PCR測(cè)定肺組織TLR2/T

2、L，R4基因的表達(dá)；用免疫印跡（Western Blotting）測(cè)定肺組織TLR2/TLR4蛋白的表達(dá)；用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）測(cè)定肺組織勻漿中IL-6的蛋白含量。
　　 結(jié)果：各高氧實(shí)驗(yàn)組肺W/D比值較對(duì)照組明顯增高（P<0.01），隨高氧暴露時(shí)間的延長(zhǎng)，肺組織呈現(xiàn)彌漫性肺泡炎和間質(zhì)水腫等病理學(xué)改變。Real-time PCR結(jié)果顯示高氧暴露組肺組織TLR2/TLR4基因表達(dá)明顯高于對(duì)照組（P<0.05），并與24h達(dá)

3、高峰。western Blotting結(jié)果顯示，高氧組TLR2/TLR4蛋白表達(dá)較對(duì)照組明顯增高（P<0.05），峰值分別在48h、72h；ELISA結(jié)果顯示高氧組肺組織勻漿IL-6蛋白含量較對(duì)照組明顯增高（P<0.05），48h達(dá)高峰。
　　 結(jié)論：在高氧引起急性肺損傷中，TLR2/TLR4在肺組織的炎癥的啟動(dòng)和維持中起重要的作用。
　　 第二部分、高氧所致氧化應(yīng)激狀態(tài)下肺泡上皮細(xì)胞Toll樣受體2/4表達(dá)及其功能研究

4、
　　 目的：觀察高氧暴露后，肺泡上皮細(xì)胞內(nèi)ROS水平與TLR2/4基因、蛋白表達(dá)變化及其信號(hào)通路的功能之間關(guān)系，探討高氧所致肺損傷炎癥反應(yīng)的可能機(jī)制。
　　 方法：體外培養(yǎng)人類肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞株A549，分別在>90％氧體積分?jǐn)?shù)高氧環(huán)境中暴露2h、6h、12h、24h及48h后（1）用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧含量；（2）用real-time PCR法檢測(cè)TLR2/4基因表達(dá)變化；（3）用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)TLR2/4蛋白

5、在細(xì)胞中的分布及其表達(dá)改變；（4）用EMSA檢測(cè)A549在高氧暴露后，細(xì)胞內(nèi)NF-KB核轉(zhuǎn)錄的變化；（5）用ELIsA檢測(cè)A549在高氧暴露后，上清液中IL-6，IL-8的含量；（6）A549細(xì)胞予以ROS清除劑NAC預(yù)處理后，高氧暴露6h，再分別測(cè)定①用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS含量；②real-time PCR法檢測(cè)TLR2/4基因表達(dá)變化；③用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)TLR2/4蛋白表達(dá)改變；④用EMsA檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)NF-KB核轉(zhuǎn)錄的變化；⑤

6、用ELISA檢測(cè)A549在高氧暴露后，上清液中IL-6，IL-8的含量。
　　 結(jié)果：A549肺泡上皮細(xì)胞有TLR2/4的表達(dá)，并且以胞內(nèi)表達(dá)為主，隨高氧暴露時(shí)間的延長(zhǎng)，胞內(nèi)ROS含量呈進(jìn)行性增高，TLR2/4表達(dá)隨之進(jìn)行性增高，細(xì)胞內(nèi)NF-κB核轉(zhuǎn)錄水平及細(xì)胞上清液中IL-6，IL-8水平也呈進(jìn)行性增高；在NAC預(yù)處理的情況下，高氧刺激后，細(xì)胞內(nèi)ROS水平明顯降低，細(xì)胞TL，R2/4表達(dá)也隨之降低，NF-κ B核轉(zhuǎn)錄活性水平及

7、細(xì)胞上清液中IL-6，IL-8水平增高不明顯，其變化與正常空氣A549細(xì)胞組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，而明顯低于高氧暴露對(duì)照組。
　　 結(jié)論：A549細(xì)胞在高氧暴露后，細(xì)胞內(nèi)ROS能夠激活人肺泡上皮細(xì)胞TLR2/4的表達(dá)，導(dǎo)致前炎癥細(xì)胞因子IL-6和IL-8的大量釋放。這一過(guò)程可能是通過(guò)TL2/TLR4-NF-kB-炎癥介質(zhì)這一信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路實(shí)現(xiàn)的。
　　 第三部分、siRNA-TLR2和siRNA-TLR4對(duì)高氧所致氧化應(yīng)激狀態(tài)下肺

8、泡上皮細(xì)胞功能的影響
　　 目的：觀察siRNA-TLR2和siRNA-TLR4轉(zhuǎn)染的A549細(xì)胞高氧暴露后，細(xì)胞TLR2/4基因、蛋白表達(dá)變化及其下游信號(hào)通路的功能，進(jìn)一步證實(shí)細(xì)胞內(nèi)ROS可激活TL2/TLR4-NF-kB-炎癥介質(zhì)這一信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，導(dǎo)致高氧肺損傷炎癥反應(yīng)的啟動(dòng)。
　　 方法：體外培養(yǎng)人類肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞株A549，分別轉(zhuǎn)染siRNA-TLR2和siRNA-TL，R4，在>90％氧體積分?jǐn)?shù)高氧環(huán)境中暴露

9、6h后（1）用real-time PCR法檢測(cè)TLR2/4基因抑制效率；（2）用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)TLR2/4蛋白抑制效率；（3）用EMSA檢測(cè)轉(zhuǎn)染后A549在高氧暴露后，細(xì)胞內(nèi)NF-KB核轉(zhuǎn)錄的變化；（4）用ELISA檢測(cè)轉(zhuǎn)染后A549在高氧暴露后，上清液中IL-6，IL-8的含量；
　　 結(jié)果：siRNA-TL.R2和siRNA-TLR4可明顯抑制A549肺泡上皮細(xì)胞高氧暴露后TLR2/4的表達(dá)，并且可以降低高氧暴露后細(xì)胞內(nèi)NF