基于抗耐藥菌活性的真菌次生代謝產(chǎn)物研究.pdf

1、細(xì)菌耐藥是本世紀(jì)全球關(guān)注的熱點(diǎn)問(wèn)題，已成為嚴(yán)重的公共衛(wèi)生危機(jī)。細(xì)菌耐藥直接導(dǎo)致患者治療失敗、醫(yī)療費(fèi)用增加、病死率上升，更為嚴(yán)重的是，耐藥菌的進(jìn)一步發(fā)展可能使人類重新面臨感染性疾病的威脅。目前加強(qiáng)抗菌藥物研發(fā)是國(guó)內(nèi)外對(duì)抗細(xì)菌耐藥的共識(shí)。真菌代謝產(chǎn)物的豐富性及其生物活性的多樣性是發(fā)現(xiàn)抗菌新藥的不竭動(dòng)力。近年來(lái)，隨著生命科學(xué)的發(fā)展，與細(xì)菌耐藥發(fā)生的相關(guān)分子機(jī)制得以闡明，并且能在體外建立藥物的作用靶點(diǎn)模型進(jìn)行大規(guī)模的藥物篩選，以及計(jì)算機(jī)虛擬分子

2、對(duì)接等新型技術(shù)手段的革新，再次掀起科學(xué)家們從微生物代謝產(chǎn)物中尋找抗耐藥菌先導(dǎo)化合物的熱潮。
　　本論文共分五個(gè)部分:
　　在第一部分中介紹了本課題的研究背景和立題依據(jù)，通過(guò)體外抑制耐藥菌活性篩選結(jié)合化學(xué)成分篩查的方法，從藥用植物（金線蓮；貫葉連翹；石蒜）以及長(zhǎng)江灘涂中分離出的50株真菌中篩選出3株（Aspergillus sp.Z12，Aspergillus sp.TJ23和Emericella sp.TJ29）具有抗耐藥菌

3、活性并且代謝產(chǎn)物豐富的潛力菌株，為后續(xù)的次生代謝產(chǎn)物研究提供了資源菌株。
　　第二部分中通過(guò)抗菌活性導(dǎo)向分離，從真菌Aspergillus sp.Z12中分離鑒定了8個(gè)naphtho-γ-pyrone類化合物，首次測(cè)試了這些naphtho-γ-pyrone類化合物對(duì)耐藥菌的活性，發(fā)現(xiàn)fonsecinones A和C以及aurasperones A和E對(duì)6株耐藥菌具有潛在的抗菌活性。其中Fonsecinone A具有最強(qiáng)的抗菌活性，

4、對(duì)產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶的大腸埃希菌（ESBL-E.coli.），銅綠假單胞菌和糞腸球菌的最低抑菌濃度（MIC）分別為4.26，17.04和4.26μg/mL。通過(guò)虛擬分子對(duì)接，微量熱泳動(dòng)（MST）和酶抑制活性試驗(yàn)首次發(fā)現(xiàn)并證實(shí)這些活性naphtho-γ-pyrones的抗菌靶點(diǎn)是細(xì)菌烯脂酰-ACP還原酶（FabI）。此外，這項(xiàng)研究也是成功使用計(jì)算機(jī)虛擬分子對(duì)接技術(shù)預(yù)測(cè)天然產(chǎn)物靶點(diǎn)的實(shí)例之一，為后續(xù)的天然產(chǎn)物的活性發(fā)現(xiàn)和靶點(diǎn)尋找奠定實(shí)踐基

5、礎(chǔ)。
　　第三部分中對(duì)Aspergillus sp.TJ23次生代謝產(chǎn)物進(jìn)行了系統(tǒng)的研究，并對(duì)分離鑒定的部分化合物進(jìn)行了抗耐藥菌和抗腫瘤活性的研究。從Aspergillus sp.TJ23大米固體發(fā)酵的乙酸乙酯提取物中共分離鑒定了14個(gè)化合物，包括5個(gè)新化合物。新化合物為1個(gè)結(jié)構(gòu)十分新穎的具有螺[雙環(huán)[3.2.2]壬烷-2,1′-環(huán)己烷]的新骨架雜萜，2個(gè)結(jié)構(gòu)新穎的雜萜，1個(gè)甾體類化合物以及1個(gè)生物堿類化合物。通過(guò)單晶衍射實(shí)驗(yàn)和大

6、量的量子化學(xué)計(jì)算，確定了所有化合物的絕對(duì)構(gòu)型?？鼓退幘钚詼y(cè)試結(jié)果顯示新骨架化合物spiroaspertrione A具有一定的抗甲氧西林耐藥的金黃色葡萄球菌（MRSA）作用，并且能夠增效β-內(nèi)酰胺類藥物甲氧西林對(duì)抗MRSA的能力，兩者聯(lián)合使用后可降低甲氧西林的MIC至1μg/mL。通過(guò)計(jì)算機(jī)模擬對(duì)接篩選，以及MST和Western Bolt實(shí)驗(yàn)證實(shí)其作用靶點(diǎn)為青霉素結(jié)合蛋白PBP2a。此外，通過(guò)進(jìn)行異檸檬酸脫氫酶1突變酶（IDH1R1

7、32H/R132C）活性篩選，新雜萜類化合物asperspiropene A在酶水平和細(xì)胞水平均表現(xiàn)出顯著活性。值得一提的是，該化合物是首個(gè)報(bào)道有IDH1R132H/R132C抑制活性的真菌代謝產(chǎn)物，可以作為新的靶向IDH1突變的抗腫瘤先導(dǎo)化合物進(jìn)行深入研究。
　　第四部分中從Emericella sp.TJ29大米固體發(fā)酵的乙酸乙酯提取物中共分離鑒定了14個(gè)化合物，其中新化合物5個(gè)。新化合物包括3個(gè)結(jié)構(gòu)新穎的雜萜，以及2個(gè)聚酮類

8、化合物。其中emervaridone A為“emervaridone雜萜骨架”的第二個(gè)化合物，并且是該碳骨架體系中，第一個(gè)H-7′為α-構(gòu)象的化合物。通過(guò)單晶衍射實(shí)驗(yàn)和量子化學(xué)計(jì)算，確定了所有新化合物的絕對(duì)構(gòu)型。通過(guò)對(duì)部分化合物抗耐藥菌活性的測(cè)試，發(fā)現(xiàn)化合物emervaridone A以及varioxiranediol A具有較強(qiáng)的抗ESBL-E.coli.以及銅綠假單胞菌活性，并且對(duì)正常人支氣管上皮細(xì)胞無(wú)明顯毒性，具有繼續(xù)進(jìn)行深入研究

9、的價(jià)值。
　　第五部分中對(duì)現(xiàn)今細(xì)菌耐藥時(shí)代下抗菌藥物發(fā)現(xiàn)的策略和相關(guān)研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述。從細(xì)菌耐藥的現(xiàn)狀，抗生素的發(fā)展歷史，細(xì)菌耐藥性形成及擴(kuò)散機(jī)制，現(xiàn)代抗菌藥物的研發(fā)策略，以及未來(lái)抗菌藥物的發(fā)展方向五個(gè)方面進(jìn)行深入探討并得出結(jié)論：天然產(chǎn)物仍然是發(fā)現(xiàn)新抗菌藥物的源泉。在現(xiàn)今細(xì)菌耐藥的時(shí)代里，可以運(yùn)用新的計(jì)算機(jī)及生物技術(shù)等將細(xì)菌耐藥機(jī)制與基于結(jié)構(gòu)的藥物發(fā)現(xiàn)方法相結(jié)合對(duì)天然產(chǎn)物進(jìn)行篩選。同時(shí)，抗菌藥物的開(kāi)發(fā)思路也需要革新—即從搜尋或開(kāi)