泰和烏骨雞活性肽抗氧化與降血壓及其補(bǔ)血作用研究.pdf

1、泰和烏骨雞(Gallus gallus domesticus brisson)是江西省重要的特色藥食資源,既是一種營養(yǎng)豐富的滋補(bǔ)食品,又是特有藥用雞種,被歷代醫(yī)家沿用,歷史悠久,名揚(yáng)中外。大量醫(yī)藥專著和文獻(xiàn)記載,烏骨雞具有補(bǔ)肝腎、益血?dú)?、退虛熱、調(diào)經(jīng)止帶等功能,還可醫(yī)治心腹痛、虛損、崩中帶下、遺精、消渴、久痢、骨折、腰酸腿痛、各種出血癥、紫癜、肝炎等疾病。因此,以泰和烏骨雞為原料生產(chǎn)的生物活性肽具有重要的研究價(jià)值。鑒于此,本論文以泰和烏

2、骨雞活性肽為研究對象,綜合運(yùn)用食品科學(xué)、現(xiàn)代分離技術(shù)、天然產(chǎn)物化學(xué)、現(xiàn)代儀器分析、細(xì)胞和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)等的一系列技術(shù)手段和研究方法,對其抗氧化活性、降血壓活性以及補(bǔ)血活性進(jìn)行了較為全面和深入的研究,主要研究內(nèi)容與結(jié)果如下:
　　 1、采用均勻設(shè)計(jì)優(yōu)化的木瓜蛋白酶酶解法制備泰和烏骨雞活性肽。該活性肽具有較強(qiáng)的O2·一、·OH、DPPH·、ABTS·+清除能力和還原能力,以及良好的Fe2+、Cu2+螯合能力和抑制脂質(zhì)過氧化能力。利用制備型

3、RP-HPLC結(jié)合水作流動(dòng)相,將泰和烏骨雞活性肽分離成四個(gè)組分(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ),組分Ⅱ具有最強(qiáng)的O2·-、DPPH·清除能力和還原能力,以及較強(qiáng)的ABTS·+清除能力,其DPPH·、ABTS·+清除能力和還原能力強(qiáng)于相同濃度下的肌肽；組分Ⅰ具有最強(qiáng)的·OH清除能力。泰和烏骨雞活性肽富含Glu、Asp、Gly、Ala以及Leu等氨基酸,以及分子量在291-6070Da的小分子肽,這些因素是泰和烏骨雞活性肽具有較強(qiáng)的抗氧化活性的重要原因。

4、
　　 2、利用超濾分離得到<6kDa的泰和烏骨雞活性肽。該活性肽具有強(qiáng)烈的O2·-、ABTS·+清除能力和還原能力,以及良好的·OH、DPPH·清除能力、Fe2+、Cu2+螯合能力和抑制脂質(zhì)過氧化能力。確定了0.01M磷酸鹽溶液(pH6.8)作為流動(dòng)相的最佳分離條件,利用制備型RP-HPLC分離<6kDa的泰和烏骨雞活性肽,得到13個(gè)組分,對其采用強(qiáng)酸型離子交換樹脂結(jié)合強(qiáng)堿型離子交換樹脂進(jìn)行脫鹽處理,得到較好的效果?？寡趸钚?/p>

5、測定表明,組分4具有強(qiáng)烈的還原能力；組分7具有最強(qiáng)的脂質(zhì)過氧化抑制活性；組分8具有強(qiáng)烈O2·-、ABTS·+清除活性和還原能力；組分13具有最強(qiáng)DPPH·清除活性。采用RP-HPLC結(jié)合水-乙腈作流動(dòng)相,梯度洗脫分離組分4、8,分別得到4個(gè)亞組分?？寡趸钚詼y定表明,組分4-3具有最強(qiáng)的還原能力；組分8-3具有最強(qiáng)的O2·-、ABTS·+清除能力和還原能力,且強(qiáng)于相同濃度下的肌肽。組分8-3純度較高,HPLC-ESI+-MS／MS鑒定出

6、其序列為Glu-Pro—Asp-Arg-Tyr。
　　 3、從豬肺中提取ACE,其酶活力為27U／mL。建立RP-HPLC結(jié)合水(0.1％甲酸)-乙腈法,測定了泰和烏骨雞活性肽的ACE抑制活性。采用體外模擬胃腸道消化法對泰和烏骨雞肉進(jìn)行酶解,隨著消化時(shí)間的增加,不同階段消化液水解度增大,小分子肽含量增加,ACE抑制活性保持在57.8％以上。首先采用超濾分離360min腸道消化液,得到<3kDa泰和烏骨雞活性肽,其ACE抑制IC5

7、0為0.56mg／mL；其次采用制備型RP-HPLC分離<3kDa活性肽,得到3個(gè)分離組分,組分F2的ACE抑制活性最強(qiáng),IC50為0.21mg／mL；最后采用凝膠柱色譜分離F2得到2個(gè)分離組分,組分F2-2的ACE抑制活性最強(qiáng),IC50為0.04mg／mL。利用HPLC／Q-TOF MS從F2-2中鑒定出一種新型的ACE抑制肽,其序列為Glu-Pro-Leu-Tyr-Tyr。
　　 4、采用細(xì)胞和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)對泰和烏骨雞活性肽及其

8、分離組分的補(bǔ)血活性進(jìn)行評價(jià)。泰和烏骨雞活性肽具有促進(jìn)正常小鼠骨髓有核細(xì)胞增殖的作用,其分離組分7、8、9、10可極顯著(P<0.01)促進(jìn)小鼠骨髓有核細(xì)胞增殖,濃度為0.1μg／mL時(shí),增殖率可達(dá)130％以上。采用RP-HPLC結(jié)合DNFB柱前衍生法測得組分7、8、9、10的氨基酸組成,它們主要含有Tyr、Gly、Glu、Asp以及Ala等氨基酸,可推測該5種氨基酸為刺激小鼠骨髓有核細(xì)胞增殖活性成分的物質(zhì)基礎(chǔ)。泰和烏骨雞活性肽可升高失血

9、性血虛小鼠的胸腺和脾臟指數(shù),增強(qiáng)血虛小鼠免疫功能,促進(jìn)機(jī)體快速造血。該活性肽還可顯著升高失血性血虛小鼠RBC值(P<0.05):可使5-氟尿嘧啶致血虛小鼠RBC、HOB、HCT值快速恢復(fù)到正常水平；可顯著升高失血、5-氟尿嘧啶共同致血虛小鼠RBC值(P<0.05),使HGB值快速恢復(fù)到正常水平。泰和烏骨雞活性肽組分8可使失血、5-氟尿嘧啶共同致血虛小鼠HGB值快速恢復(fù)到正常水平,并能快速升高血虛小鼠RBC、HCT值。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果明確表明