IGF-1和IL-10基因轉(zhuǎn)導(dǎo)對(duì)NOD鼠1型糖尿病的防治作用及機(jī)制探討.pdf

1、1型糖尿病(Type1 diabetes mellitus，T1DM)是兒童及青少年較常見的內(nèi)分泌疾病，發(fā)病率逐漸上升，并且近年來呈現(xiàn)發(fā)病年齡早、病情重的趨勢(shì)，是一種嚴(yán)重威脅兒童健康的重要疾病。從胰島B細(xì)胞發(fā)生自身免疫性損傷到出現(xiàn)糖尿病癥狀往往需要一個(gè)較長(zhǎng)的過程，因而針對(duì)1型糖尿病免疫調(diào)節(jié)治療越來越受到重視。目前常用的免疫調(diào)節(jié)治療主要集中在抗原特異性、抗原非特異性免疫調(diào)節(jié)治療和促進(jìn)胰島β細(xì)胞再生等措施方面，這些措施的聯(lián)合應(yīng)用也就是所謂的

2、雞尾酒療法，有可能實(shí)現(xiàn)在較低的毒副作用基礎(chǔ)上達(dá)到更有效的干預(yù)效果。因此本課題嘗試在T1DM發(fā)病前期應(yīng)用白細(xì)胞介素10(interleukin-10，IL-10)進(jìn)行免疫干預(yù)，逆轉(zhuǎn)Th1/Th2偏移，阻止胰島β細(xì)胞的自身免疫性損害；并聯(lián)合應(yīng)用胰島素樣生長(zhǎng)因子-1(insulin growth factor-1，IGF-1)保護(hù)殘存的β細(xì)胞功能，促進(jìn)β細(xì)胞再生，以期達(dá)到預(yù)防或減輕T1DM的目的。由于這兩種細(xì)胞因子半衰期都較短，限制了其應(yīng)用，

3、所以我們前期已經(jīng)構(gòu)建完成攜有這兩種細(xì)胞因子的腺病毒載體，并且已經(jīng)完成腺病毒介導(dǎo)IGF-1基因的細(xì)胞學(xué)驗(yàn)證(注：IL-10腺病毒載體由本人碩士期間構(gòu)建，IGF-1腺病毒載體由本課題組其他成員構(gòu)建完成并通過細(xì)胞學(xué)驗(yàn)證)。本研究將IL-10基因作用于體外培養(yǎng)的β細(xì)胞以了解其對(duì)胰島β細(xì)胞的作用，并進(jìn)一步將IGF-1基因和/或IL-10基因作用于非肥胖性糖尿病(nonobese diabetic，NOD)鼠體內(nèi)，以了解其對(duì)T1DM防治作用及可能的

4、機(jī)制。本課題共包括兩部分。
　　 第一部分
　　 目的:了解鼠白細(xì)胞介素10(mIL-10)基因轉(zhuǎn)移對(duì)細(xì)胞因子誘導(dǎo)的RINm5F胰島β細(xì)胞凋亡及胰島素釋放功能的影響，以探討其對(duì)1型糖尿病的潛在治療價(jià)值。
　　 方法攜帶有IL-10基因的重組腺病毒載體Ad-IL-10感染RINm5F，RT-PCR、Western印跡及酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)分別檢測(cè)IL-10基因和蛋白表達(dá)，四甲基偶氮唑鹽(MTT)分析細(xì)胞活

5、力。檢測(cè)加入白細(xì)胞介素1-β(IL-1β)誘導(dǎo)細(xì)胞破壞后，Ad-IL-10對(duì)糖刺激胰島素釋放實(shí)驗(yàn)的影響；對(duì)培養(yǎng)上清中一氧化氮(NO)、一氧化氮合酶(NOS)水平的影響；Hoechst33258核染色分析細(xì)胞凋亡，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面Fas表達(dá)。
　　 結(jié)果:RINm5F細(xì)胞中檢測(cè)到mIL-10基因及蛋白的有效表達(dá)，細(xì)胞培養(yǎng)液中可測(cè)得IL-10基因表達(dá)。IL-10重組腺病毒感染胰島β細(xì)胞后仍具有在高糖濃度下刺激胰島素分泌的功能；

6、將IL-1β作用于細(xì)胞后，Ad-IL-10可以部分對(duì)抗IL-1β引起的糖刺激胰島素分泌降低，較其他2組相比差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。RINm5F細(xì)胞中加入IL-1β后，可增加細(xì)胞培養(yǎng)液中NO、NOS水平、Fas表達(dá)陽性細(xì)胞數(shù)和胰島細(xì)胞凋亡率，Ad-IL-10感染后可以降低NO、NOS水平，減少Fas表達(dá)陽性細(xì)胞數(shù)，減低胰島細(xì)胞凋亡率，較正常對(duì)照+IL-1β組及Ad-GFP+IL-1β組，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

7、　　 結(jié)論:攜有IL-10基因的重組腺病毒載體作用于胰島素分泌細(xì)胞，IL-10 mRNA和蛋白可有效表達(dá)，胰島β細(xì)胞活力不受影響。IL-10基因可抑制IL-1β誘導(dǎo)的糖刺激胰島素分泌降低并通過抑制細(xì)胞表面Fas表達(dá)而起到抗凋亡作用。
　　 第二部分
　　 目的:觀察腺病毒介導(dǎo)的胰島素樣生長(zhǎng)因子-1(Ad-IGF-1)和/或白細(xì)胞介素10基因(Ad-IL-10)對(duì)非肥胖性糖尿病鼠(NOD)鼠胰島炎及胰島β細(xì)胞凋亡的影響及

8、其對(duì)胰島β細(xì)胞的保護(hù)作用。
　　 方法:雌性NOD鼠隨機(jī)分為Ad-IGF-1組、Ad-IL-10組、Ad-IGF-1+Ad-IL-10組、腺病毒空載體Ad-GFP組、生理鹽水對(duì)照組。分別腹腔注射Ad-IGF-1、Ad-IL-10、Ad-IGF-1+Ad-IL-10、Ad-GFP、生理鹽水各100ul，3周后重復(fù)1次。每周監(jiān)測(cè)血糖，體質(zhì)量變化及糖尿病發(fā)病率。免疫組化檢測(cè)胰腺IGF-1、IL-10表達(dá)，ELISA法檢測(cè)血清IL-10

9、、IGF-1及胰島素水平，病理學(xué)檢查胰島炎程度，TUNEL法觀察胰島細(xì)胞的凋亡并計(jì)數(shù)胰島β細(xì)胞凋亡率，免疫組化分析各組Fas，Caspase-3蛋白表達(dá)。
　　 結(jié)果:腹腔注射Ad-IGF-1、Ad-IL-10可使IGF-1、IL-10在胰腺表達(dá)增強(qiáng)，IGF-1、IL-10單基因治療可以減少糖尿病的累積發(fā)病率，延緩糖尿病的發(fā)生，增加體質(zhì)量，IGF-1+IL-10聯(lián)合治療組較以上效果更加明顯，P<0.01。Ad-IGF-1組、Ad

10、-IL-10組胰島炎積分、β細(xì)胞凋亡率均明顯低于Ad-GFP組及生理鹽水組(P<0.01)，而Ad-IGF-1+Ad-IL-10組胰島炎積分、β細(xì)胞凋亡率低于Ad-IGF-1組、Ad-IL-10組(P<0.01)。免疫組化顯示IGF-1、IL-10單基因干預(yù)可使Fas、Caspase-3蛋白低表達(dá)，聯(lián)合基因干預(yù)組較單基因干預(yù)組Fas、Caspase-3蛋白表達(dá)水平更低，P<0.01。
　　 結(jié)論:應(yīng)用Ad-IGF-1、Ad-IL