和厚樸酚抑制線粒體可溶蛋白誘導小膠質細胞活化的體外實驗研究.pdf

1、目的：研究和厚樸酚對線粒體可溶蛋白誘導小膠質細胞活化的抑制作用。
　　 方法：BV2小膠質細胞復蘇后加入完全培養(yǎng)基(10％FBS-DMEM)，置于5％CO2培養(yǎng)箱內常規(guī)培養(yǎng)，取對數生長期，隨機分為3組:(1)空白對照組(control):加無血清培養(yǎng)基;(2)線粒體可溶蛋白組(MDP):接種24h后行1μg/ml、10g/ml、100μg/ml濃度MDP按1、3、5、7h處理。(3)和厚樸酚干預組(HNK):和厚樸酚孵育30mi

2、n后行MDP處理，且和厚樸酚存在于MDP作用整個過程。ELISA分別檢測以0μg/ml、1μg/ml、10μg/ml、100μg/ml濃度MDP刺激7h時的細胞上清液中白細胞介素IL-6和TNF-α含量;和以MDP為100μg/ml處理1、3、5、7h白細胞介素IL-6和TNF-α含量;根據前兩組結果，檢測HNK組與MDP組的白細胞介素IL-6和TNF-α含量;采用RT-PCR方法半定量測定空白對照組、MDP組與HNK組轉錄因子Klf4

3、的表達情況;倒置相差顯微鏡觀察各組細胞形態(tài)變化及免疫熒光染色顯示IBA1蛋白的表達情況。
　　 結果：1.ELISA結果:當MPS濃度為1μg/ml處理7h時，與對照組比較細胞上清液中白細胞介素IL-6和TNF-α含量表達差異無統計學意義(p＞0.05);當MPS濃度為10μg/ml或100μg/ml處理7h時，組間差異有統計學意義(p＜0.05)，提示小膠質細胞激活呈現一定的濃度依賴性;當MPS為100μg/ml時，在1、3、

4、5、7h各時間點細胞上清液中白細胞介素IL-6和TNF-α含量表達水平與空白對照組比較組間差異有統計學意義(p＜0.05)，提示隨著刺激時間的延長，小膠質細胞活化程度增強，當MPS為100μg/ml時處理7h時，檢測HNK組與MDP組的上清液中白細胞介素IL-6和TNF-α含量有明顯統計學差異(p＜0.05)，提示和厚樸酚能夠抑制小膠質細胞的活化，降低了炎性介質的釋放。
　　 2.RT-PCR結果:MDP組與空白組和HNK組比較

5、組間差異均有統計學意義，說明線粒體可溶蛋白刺激小膠質細胞后Klf4明顯上調，而和厚樸酚能下調活化的小膠質細胞Klf4表達。
　　 3.形態(tài)學觀察:倒置相差顯微鏡觀察到空白組細胞主要表現為胞體較小，突起呈分枝狀;MDP組明顯表現為小膠質細胞的胞體變圓或者橢圓，突起消失，呈“阿米巴”狀。而HNK組活化狀態(tài)的小膠質細胞明顯減少。熒光顯微鏡下觀察免疫熒光染色BV2小膠質細胞在無MDP刺激的情況下，Ibal蛋白沒有表達。MDP組小膠質細胞