尼古丁對脂多糖誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞激活及活化后細(xì)胞死亡的影響.pdf

1、目的： 研究發(fā)現(xiàn)：在中樞神經(jīng)退變性疾病的發(fā)生過程中，小膠質(zhì)細(xì)胞的過度激活可以引起嚴(yán)重的腦組織損傷；相反，抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的過度活化將有助于神經(jīng)退變性疾病的恢復(fù)。尼古丁(Nicotine，NIC)，又名煙堿，是煙草中主要的生物堿，吸煙是最常見的攝入尼古丁的方式之一。長期以來，尼古丁被單一的認(rèn)為只對機體產(chǎn)生不利的影響：是引起肺癌、胎兒流產(chǎn)、成癮性危害、心肺功能損害以及神經(jīng)系統(tǒng)毒性等損傷的高危因素。最近的研究發(fā)現(xiàn)，使用不同劑量、經(jīng)過不同

2、時間的處理，尼古丁能夠在中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)產(chǎn)生與以往傳統(tǒng)觀點不同的影響：例如提高情緒、集中注意力、加強學(xué)習(xí)和記憶能力等；此外，尼古丁作為阿爾茨海默病(AD)、帕金森氏病(PD)、潰瘍性結(jié)腸炎(UC)、敗血癥、口腔潰瘍等疾病的潛在性治療方法的研究工作已經(jīng)被展開。越來越多的證據(jù)表明：尼古丁對機體能夠產(chǎn)生一些有利的影響，通過調(diào)節(jié)先天性免疫反應(yīng)和獲得性免疫反應(yīng)，對炎癥反應(yīng)具有抑制作用。研究表明，細(xì)胞因子(如促炎因子、抗炎因子等)對于炎癥反應(yīng)

3、的調(diào)控起到極其重要的作用；在炎癥反應(yīng)發(fā)生過程中，尼古丁通過與α7尼古丁型乙酰膽堿能受體(a7nACHRs)作用啟動“膽堿能抗炎途徑”，抑制促炎性細(xì)胞因子基因的表達(dá)、減少炎性因子的釋放，發(fā)揮抗炎作用。迄今為止，多種nACHRs在B淋巴細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞等細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)和鑒定，尼古丁通過不同nACHRs發(fā)揮廣泛的生物學(xué)作用。目前，尼古丁在炎癥抑制過程中扮演的角色越來越受到重視，但其具體機制還

4、不完全清楚。本研究通過體內(nèi)和體外實驗，就尼古丁對脂多糖誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞激活及過度活化后引起的細(xì)胞死亡的影響進行研究，觀察尼古丁在以小膠質(zhì)細(xì)胞激活為標(biāo)志的中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥反應(yīng)中的影響，并探討其作用機理。 方法: 一、體內(nèi)實驗 1、健康、雄性昆明小鼠，按實驗要求分為對照(CON)組、NIC組、脂多糖(LPS)組、NIC+LPS組，腹腔注射尼古丁建立慢性暴露尼古丁的動物模型，腹腔注射LPS誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞的激活。

5、 2、免疫組織化學(xué)方法檢測各組大腦皮質(zhì)、海馬、黑質(zhì)CD11b陽性小膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)情況。 二、體外實驗 1、BV2細(xì)胞傳代培養(yǎng)，分為CON組、NIC組、LPS組、NIC+LPS組。 2、CCK-8法檢測各組BV2細(xì)胞的細(xì)胞活性。 3、一氧化氮(NO)檢測試劑盒檢測各組NO釋放情況。 4、RT-PCR法檢測各組誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)、腫瘤壞死因子(TNF-α)、白細(xì)胞介素1(IL-1β)、白細(xì)胞

6、介素6(IL-6)、環(huán)氧化酶(COX-2)等炎性因子mRNA以及干擾素調(diào)節(jié)因子1(IRF-1)、Caspase-11mRNA的表達(dá)。 5、Western-Blot法檢測各組BV2細(xì)胞Caspase-3，P-I-kB蛋白表達(dá)情況。 結(jié)果: 1、CON組與NIC組CD11b陽性小膠質(zhì)細(xì)胞胞體小，呈桿狀，突起細(xì)長，染成淺棕色；LPS組小鼠腦內(nèi)CD11b陽性小膠質(zhì)細(xì)胞胞體增大，呈圓形，突起粗而短，染成棕褐色；NIC+LP

7、S組少量CD11b陽性小膠質(zhì)細(xì)胞胞體增大，圓形，突起變粗變短，染成深棕色，多數(shù)呈桿狀，突起少、細(xì)長，染成淺棕色。 2、各組BV2細(xì)胞細(xì)胞活性隨培養(yǎng)時間延長下降。CON組與NIC組BV2細(xì)胞貼壁生長，呈桿狀；LPS組BV2細(xì)胞大量懸浮，可見殘留的分解產(chǎn)物和細(xì)胞碎片；NIC+LPS組BV2細(xì)胞多數(shù)貼壁生長，激活誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡(AICD)數(shù)量減少。 3、各組BV2細(xì)胞NO釋放量隨培養(yǎng)時間延長增加。在不同的時間點LPS組BV2細(xì)

8、胞NO釋放量最多；NIC+LPS組NIC干預(yù)后NO釋放量較之減少。 4、在mRNA水平，LPS組iNOS、TNF-α、IL-1β、IL-6、COX-2、IRF-1、Caspase-11等表達(dá)明顯增加，在NIC+LPS組NIC干預(yù)后炎性因子等表達(dá)下降。 5、LPS組P-I-kB，活化Caspase-3(20KD)蛋白表達(dá)增加；在NIC+LPS組NIC干預(yù)后P-I-kB，活化Caspase-3(20KD)蛋白表達(dá)降低。