Sox9增強(qiáng)骨形態(tài)發(fā)生蛋白2誘導(dǎo)的間充質(zhì)干細(xì)胞成軟骨分化抑制成骨分化.pdf

1、研究背景/目的:構(gòu)建基因強(qiáng)化的組織工程軟骨用于修復(fù)軟骨缺損在臨床上具有廣闊的運用前景。骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(Bone morphogeneticprotein2，BMP2)是誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)成軟骨分化效應(yīng)最強(qiáng)的因子之一，但是它同時具有誘導(dǎo)MSCs成骨分化和激發(fā)軟骨內(nèi)成骨的能力，這限制了BMP2發(fā)揮最大的成軟骨效應(yīng)。通過聯(lián)合運用其他成軟骨分化因子如:Sox9，從而發(fā)揮BMP2最大的成軟

2、骨分化效應(yīng)并抑制BMP2介導(dǎo)的成骨分化效應(yīng)和軟骨內(nèi)化骨是成功構(gòu)建組織工程軟骨的方法之一。本研究主要探討Sox9對BMP2誘導(dǎo)MSCs成骨、成軟骨分化和軟骨內(nèi)化骨的影響，為組織工程軟骨的成功構(gòu)建提供實驗和理論基礎(chǔ)。
　　方法:
　　(1)重組腺病毒AdBMP2和AdSox9介導(dǎo)BMP2和Sox9的表達(dá)，AdGFP作為對照。用HEK293細(xì)胞擴(kuò)增腺病毒后轉(zhuǎn)染小鼠骨髓MSCsC3H10T1/2，RT-PCR鑒定目的基因BMP2和S

3、ox9的表達(dá)。Western-blot檢測各處理組在不同時間點Sox9蛋白表達(dá)情況;
　　(2)用AdBMP2和/或AdSox9轉(zhuǎn)染MSCs，AdGFP作對照，體外微球培養(yǎng)2-14天，阿爾新藍(lán)染色和定量檢測各處理組不同時間點糖胺聚糖合成情況，QPCR檢測各處理組不同時間點成軟骨分化標(biāo)志物ACAN、Col2a1 mRNA合成情況;Western-blot檢測各處理組不同時間點Col2a1蛋白表達(dá)變化;
　　(3)體外培養(yǎng)C3H

4、10T1/2細(xì)胞，AdBMP2和/或AdSox9轉(zhuǎn)染MSCs，AdGFP作對照，ALP染色和讀數(shù)檢測各處理組ALP活性變化;茜素紅S染色檢測各處理組成骨分化晚期鈣鹽沉積情況;免疫細(xì)胞化學(xué)檢測各處理組細(xì)胞基質(zhì)OPN表達(dá)情況;QPCR檢測各處理組不同時間點成骨分化因子Runx2、OPN和OC表達(dá)變化;Western-blot檢測各處理組不同時間點Runx2、OPN和OC蛋白表達(dá)變化;
　　(4)構(gòu)建裸鼠皮下成軟骨/成骨模型，通過大體形

5、態(tài)和組織染色進(jìn)一步證實Sox9對BMP2誘導(dǎo)C3H10T1/2細(xì)胞成軟骨分化、成骨分化和軟骨內(nèi)化骨的影響;
　　(5)通過胎鼠前肢器官培養(yǎng)，證實Sox9對BMP2誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞增殖、分化、肥大和骨化的影響。
　　結(jié)果:
　　(1)重組腺病毒能有效轉(zhuǎn)染C3H10T1/2細(xì)胞并表達(dá)目的基因;BMP2能夠誘導(dǎo)Sox9的表達(dá)，當(dāng)AdBMP2與AdSox9聯(lián)合作用時，Sox9能早期和持續(xù)表達(dá)。
　　(2)在體外微球培養(yǎng)中，S

6、ox9能增強(qiáng)BMP2誘導(dǎo)的MSCs成軟骨分化標(biāo)志物(ACAN、Col2a1、糖胺聚糖)的表達(dá)。
　　(3)在體外實驗中，Sox9抑制BMP2誘導(dǎo)的MSCs早期(ALP活性，Ruxn2）和晚期（鈣鹽沉積、OPN、OC）成骨分化標(biāo)志物表達(dá)。
　　(4)裸鼠體內(nèi)實驗進(jìn)一步證實Sox9促進(jìn)BMP2誘導(dǎo)的軟骨形成，抑制BMP2介導(dǎo)的軟骨內(nèi)化骨，并維持軟骨細(xì)胞表型。
　　(5)胎鼠前肢器官培養(yǎng)證實BMP2和Sox9協(xié)同促進(jìn)肢芽干骺