酵母內(nèi)質(zhì)網(wǎng)嵌膜GTP酶Seylp的表達(dá)、純化及結(jié)晶.pdf

1、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是廣泛分布于真核細(xì)胞中的一類在形態(tài)、功能上保守的細(xì)胞器。在形態(tài)學(xué)上，可以將內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分為管狀內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、片層狀內(nèi)質(zhì)網(wǎng)兩大基本形態(tài)，并且這兩種形態(tài)發(fā)揮著不同的生理功效?，F(xiàn)已有研究發(fā)現(xiàn)，許多蛋白質(zhì)參與到了管狀內(nèi)質(zhì)網(wǎng)形態(tài)的維持這一過程中。Seylp蛋白是酵母體內(nèi)的一類dynamin家族GTPase膜嵌GTPase蛋白，定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)并在管狀內(nèi)質(zhì)網(wǎng)處富集。有研究表明Seylp與其哺乳動(dòng)物同源蛋白A1tastin對(duì)管狀內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的形態(tài)維持起到關(guān)鍵的作用。

2、為了研究Seylp蛋白如何維持管狀內(nèi)質(zhì)網(wǎng)形態(tài)，以及其探究其介導(dǎo)膜的融合/裂解方面的分子機(jī)制，本研究從結(jié)構(gòu)生物學(xué)、生物化學(xué)的角度出發(fā)來研究Seylp蛋白在對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)塑形方面的精確工作機(jī)制。
　　 本實(shí)驗(yàn)首先成功構(gòu)建了Seylp的N端胞漿區(qū)全長(zhǎng)的載體，然后通過二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)、胰酶不完全降解實(shí)驗(yàn)、質(zhì)譜分析以及對(duì)Seylp結(jié)構(gòu)域的分析，確定了不同的克隆片段，并將蛋白在大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)，利用不同的純化方法最到了高純度的蛋白。接下來，通過分子

3、篩層析分析、GTPase酶活分析等手段確定了具有生物學(xué)活性且性質(zhì)穩(wěn)定的蛋白片段。在此基礎(chǔ)上對(duì)相應(yīng)蛋白進(jìn)行了晶體的篩選工作，最終得到了相應(yīng)的蛋白晶體，但X衍射初步分析表明，晶體的衍射效果不佳。
　　 為了提高晶體的衍射質(zhì)量，對(duì)蛋白進(jìn)行了不同處理，對(duì)結(jié)晶條件進(jìn)行了進(jìn)一步優(yōu)化，并通過對(duì)晶體本身進(jìn)行了不同方式的處理。通過綜合運(yùn)用以上手段，極大的提高了晶體的衍射質(zhì)量。通過目前所得到的研究結(jié)果，使我們對(duì)Seylp蛋白發(fā)揮生理功效的方式有了進(jìn)