基于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的翹嘴鱖微衛(wèi)星標(biāo)記的開(kāi)發(fā)及MHC classI基因的克隆表達(dá).pdf

1、翹嘴鱖(Siniperca chuatsi)隸屬于鱸形目(Perciformes)、鱖亞科(Sinipercinae)、鱖屬(Siniperca)，俗稱桂魚、桂花魚、胖鱖、季花魚等，是淡水底棲的肉食性魚類。它具有體型大、生長(zhǎng)快、味道鮮美等特點(diǎn)，是我國(guó)重要的名貴經(jīng)濟(jì)魚類和養(yǎng)殖對(duì)象。但是，近年來(lái)由于江河過(guò)度捕撈、水域生態(tài)環(huán)境惡化及養(yǎng)殖生產(chǎn)中近親繁殖等原因，導(dǎo)致自然種質(zhì)資源衰退、養(yǎng)殖種質(zhì)性狀退化、魚類疾病不斷爆發(fā)等現(xiàn)狀，已影響到翹嘴鱖種質(zhì)延續(xù)

2、及其養(yǎng)殖業(yè)的正常發(fā)展。迫切需要運(yùn)用現(xiàn)代分子生物學(xué)手段開(kāi)展翹嘴鱖種質(zhì)資源保護(hù)及良種選育等方面的研究。為此，本研究采用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)開(kāi)發(fā)了與翹嘴鱖生長(zhǎng)相關(guān)EST-SSR分子標(biāo)記，分析了部分與經(jīng)濟(jì)性狀相關(guān)的基因位點(diǎn)，檢測(cè)了翹嘴鱖4個(gè)養(yǎng)殖群體（鄱陽(yáng)湖、洞庭湖、太湖和長(zhǎng)江口群體）的遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳多樣性；克隆了翹嘴鱖MHC class I基因并進(jìn)行了不同組織的表達(dá)分析，旨在為翹嘴鱖種質(zhì)資源保護(hù)及良種選育提供理論基礎(chǔ)，主要研究結(jié)果如下：
　　1

3、基于翹嘴鱖轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的EST-SSR標(biāo)記開(kāi)發(fā)、驗(yàn)證
　　1通過(guò)Illumina高通量測(cè)序平臺(tái)對(duì)翹嘴鱖進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。組裝和轉(zhuǎn)錄組拼接后共得到51245條unigenes，在35285個(gè)(68.86％) unigenes中共檢測(cè)到14094個(gè)SSR位點(diǎn)，微衛(wèi)星分布頻率和密度分別是27.51%和184 per Mb。共有7335個(gè)位點(diǎn)被成功設(shè)計(jì)引物，其中生長(zhǎng)、發(fā)育、增值和免疫功能二級(jí)分類條目引物共有1261對(duì)。隨機(jī)選取100對(duì)引物進(jìn)

4、行多態(tài)性驗(yàn)證，得到多態(tài)性引物20對(duì)。
　　2選取篩選得到的13對(duì)多態(tài)性引物對(duì)翹嘴鱖4個(gè)養(yǎng)殖群體的各30尾個(gè)體進(jìn)行基因掃描，共得到262個(gè)等位基因，等位基因數(shù)從2-3不等，平均等位基因數(shù)2.15，平均有效等位基因數(shù)1.80，平均觀測(cè)雜合度0.52，平均期望雜合度0.43，平均多態(tài)信息含量0.34，達(dá)到中度多態(tài)水平（0.25洞庭湖群體>長(zhǎng)江口群體>鄱陽(yáng)湖群體。
　　3對(duì)翹

5、嘴鱖4個(gè)群體間遺傳相似度和遺傳距離的檢測(cè)結(jié)果表明，鄱陽(yáng)湖和長(zhǎng)江口群體之間遺傳距離最大（0.1302），遺傳相似性系數(shù)最?。?.8757），說(shuō)明兩者親緣關(guān)系較遠(yuǎn)；鄱陽(yáng)湖和洞庭湖群體遺傳距離最?。?.0562），遺傳相似性系數(shù)最大（0.9453），說(shuō)明兩者親緣關(guān)系較近。采用UPGMA法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹表明，洞庭湖和鄱陽(yáng)湖群體先聚為一支，然后與太湖群體聚合，最后與長(zhǎng)江口群體聚合。
　　2基于EST-SSR標(biāo)記的翹嘴鱖生長(zhǎng)性狀相關(guān)分析

6、>　　采用翹嘴鱖轉(zhuǎn)錄組測(cè)序開(kāi)發(fā)的13對(duì)多態(tài)性EST-SSR引物，對(duì)60尾翹嘴鱖的體長(zhǎng)、體高、體厚及體重4種生長(zhǎng)性狀進(jìn)行標(biāo)記-性狀相關(guān)性研究，結(jié)果表明：13個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)中有5個(gè)位點(diǎn)與翹嘴鱖生長(zhǎng)性狀顯著相關(guān)，C10127位點(diǎn)與體長(zhǎng)顯著相關(guān)（P<0.05），與體厚極顯著相關(guān)（P<0.01），AA型是體長(zhǎng)、體厚的優(yōu)勢(shì)基因型，AC型是劣勢(shì)基因型；C19016位點(diǎn)與體重顯著相關(guān)（P<0.05），AB型是體長(zhǎng)的優(yōu)勢(shì)基因型；C14847位點(diǎn)與體長(zhǎng)極顯著

7、相關(guān)（P<0.01），與體高、體厚、體重顯著相關(guān)（P<0.05），BB型是體厚的優(yōu)勢(shì)基因型； C12350位點(diǎn)與體長(zhǎng)極顯著相關(guān)（P<0.01），與體重顯著相關(guān)（P<0.05），BC型是體長(zhǎng)，體高、體厚和體重4種性狀的優(yōu)勢(shì)基因型，而AC和CC是體長(zhǎng)的劣勢(shì)基因型； C18691位點(diǎn)與體高顯著相關(guān)（P<0.05），與體厚、體重極顯著相關(guān)（P<0.01），BB型為4種生長(zhǎng)性狀的優(yōu)勢(shì)基因型，AA型為劣勢(shì)基因型。
　　3翹嘴鱖MHC clas

8、s I基因的克隆及表達(dá)分析
　　1根據(jù)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序獲得的部分翹嘴鱖MHC class I cDNA片段設(shè)計(jì)引物，對(duì)其5’端和3’端分別進(jìn)行RACE克隆，獲得翹嘴鱖MHC class I基因cDNA全長(zhǎng)1925bp，包含74bp的5’非編碼區(qū)（5’-UTR）、1071bp的開(kāi)放閱讀框，預(yù)測(cè)編碼356個(gè)氨基酸、780bp的3’非編碼區(qū)（3’-UTR），3’-UTR具有明顯的終止密碼子TAA、多聚腺苷酸加尾信號(hào)（AATAAA）和PolyA

9、尾巴。翹嘴鱖MHC class I基因編碼的蛋白屬于跨膜蛋白，存在分泌信號(hào)肽結(jié)構(gòu)。將所得MHC class I基因所對(duì)應(yīng)氨基酸與幾種魚和人類MHC class I分子利用DNAMAN和MEGA軟件分別進(jìn)行比對(duì)和繪制分子進(jìn)化樹，經(jīng)ClustalW2進(jìn)行同源性分析，發(fā)現(xiàn)與細(xì)條石頜鯛（Lithognathus mormyrus）、金頭鯛（Sparus aurata）、紅笛鯛（Lutjanus sanguineus）、狼鱸（Dicentrarc