miR-93靶向RAB11FIP1在宮頸癌發(fā)生中的作用及機(jī)制.pdf

1、宮頸癌(Cervical Cancer, CC)是全球女性最常見的婦科惡性腫瘤之一。隨著宮頸癌篩查的普及以及對(duì)于宮頸癌前病變的及時(shí)治療，使得宮頸癌的發(fā)生率在發(fā)達(dá)地區(qū)顯著下降，但在欠發(fā)達(dá)地區(qū)由于篩查未開展或不規(guī)范，宮頸癌的發(fā)生率仍然保持較高的水平。同時(shí)宮頸癌也是死亡率較高的女性惡性腫瘤，嚴(yán)重威脅廣大婦女的健康。業(yè)已公認(rèn)，高危人乳頭瘤病毒（High Risk Human papillomavirus，HR-HPV）感染是宮頸癌發(fā)病的必需因素

2、，但不是惟一因素，除病毒感染以外，宿主因素也制約了疾病的發(fā)生和發(fā)展。研究這些因素在在宮頸癌發(fā)生與進(jìn)展過程中的作用與機(jī)制，對(duì)制定宮頸癌防控新策略具有十分重要的意義。miRNA是一類非編碼小分子單鏈RNA，可以與靶基因mRNA3'非翻譯區(qū)結(jié)合，引起靶基因mRNA降解或翻譯抑制，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。最近的研究發(fā)現(xiàn)，miRNAs的表達(dá)異常與腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切，但miRNA在不同的組織和細(xì)胞中發(fā)揮的生物學(xué)功能和機(jī)制并不相同，具有組織與

3、細(xì)胞特異性和時(shí)效性的特點(diǎn)。另外，同一個(gè)miRNA可以有多個(gè)不同的靶基因，多個(gè)不同的miRNA也可以同時(shí)作用于一個(gè)靶基因，從而造成不盡相同的生物學(xué)功能。因此，miRNA及其靶分子構(gòu)成了一個(gè)巨大的錯(cuò)綜復(fù)雜的生物調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。已有研究發(fā)現(xiàn)，miRNAs在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中的發(fā)揮了重要作用。迄今已發(fā)現(xiàn)多種miRNA在宮頸癌中表達(dá)下降，并通過各自不同的靶基因調(diào)控宮頸細(xì)胞的生物學(xué)行為，參與宮頸癌的發(fā)生、侵襲、轉(zhuǎn)移等過程。闡明miRNA在宮頸癌發(fā)生發(fā)展

4、過程中的作用及機(jī)制對(duì)探索宮頸癌防治新策略有重要意義。本課題組前期通過宮頸癌相關(guān)miRNA芯片篩查發(fā)現(xiàn)，在宮頸癌組織表達(dá)改變的眾多miRNA中，miR-93表達(dá)升高。在此基礎(chǔ)上，本研究首先驗(yàn)證miR-93在宮頸癌、高級(jí)別CIN和正常組織中的表達(dá)差異，并比較分析miR-93的表達(dá)水平與宮頸癌臨床不良預(yù)后因素的相關(guān)性。再通過基因功能實(shí)驗(yàn)，探尋miR-93的異常表達(dá)對(duì)宮頸癌細(xì)胞生物學(xué)行為的可能作用并確定其發(fā)揮作用的靶基因。旨在為探尋宮頸癌發(fā)生與

5、進(jìn)展新機(jī)制及宮頸癌防控新策略提供科學(xué)依據(jù)。本研究分為三個(gè)部分：
　　第一部分：宮頸癌及高級(jí)別CIN組織中miR-93表達(dá)及意義。
　　目的：驗(yàn)證miR-93在宮頸癌及高級(jí)別CIN組織中表達(dá)上調(diào)，并探討miR-93表達(dá)與宮頸癌不良預(yù)后因素之間的相關(guān)性。
　　方法：收集宮頸鱗癌168例、CIN2-360例和正常上皮48例組織標(biāo)本，采用Stem-loopRT-PCR和Real time PCR法檢測(cè)miR-93表達(dá)水平，并收

6、集宮頸癌患者的臨床病理資料，分析miR-93的表達(dá)水平與宮頸癌臨床不良預(yù)后因素的相關(guān)性。
　　結(jié)果：⑴miR-93在宮頸鱗癌和CIN2-3組織中的表達(dá)水平與宮頸正常上皮組織相比顯著上調(diào)，但兩者間無顯著差異。⑵miR-93表達(dá)與宮頸癌FIGO分期、盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、深間質(zhì)浸潤(rùn)、陰道壁累及以及脈管浸潤(rùn)無關(guān)。
　　結(jié)論：①宮頸癌組織中miR-93表達(dá)水平顯著高于宮頸正常組織，但與宮頸癌不良預(yù)后因素?zé)o顯著相關(guān)性。②高級(jí)別CIN組織中m

7、iR-93表達(dá)水平顯著高于宮頸正常組織，而高級(jí)別CIN組織與癌組織相比miR-93表達(dá)水平無差異，提示miR-93表達(dá)改變?cè)趯m頸癌發(fā)生發(fā)展進(jìn)程中可能是一個(gè)早期事件。
　　第二部分：miR-93對(duì)宮頸癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。
　　目的：明確miR-93對(duì)宮頸癌細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲等生物學(xué)行為的調(diào)控作用。
　　方法：在宮頸癌細(xì)胞株Siha和CaSki中，利用細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)抑制miR-93的表達(dá)，利用MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力，

8、流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期分布，Transwell侵襲試驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的侵襲能力。
　　結(jié)果：⑴在宮頸癌細(xì)胞中，下調(diào)miR-93表達(dá)抑制Siha和CaSki細(xì)胞的增殖，促進(jìn)細(xì)胞的凋亡。⑵在宮頸癌細(xì)胞中，下調(diào)miR-93表達(dá)不改變細(xì)胞周期和侵襲力。
　　結(jié)論：miR-93表達(dá)下調(diào)抑制宮頸癌細(xì)胞增殖并促進(jìn)凋亡，但對(duì)G1期細(xì)胞比例和細(xì)胞侵襲力沒有影響，與miR-93主要在宮頸癌發(fā)生階段發(fā)揮癌基因功能相符。
　　第三部分：

9、miR-93在宮頸癌細(xì)胞中靶向調(diào)控RAB11FIP1蛋白表達(dá)。
　　目的：確定miR-93的靶基因，以揭示miR-93促宮頸癌發(fā)生過程中的分子機(jī)制。
　　方法：通過軟件預(yù)測(cè)miR-93靶基因。用miR-93 inhibitor轉(zhuǎn)染宮頸癌細(xì)胞株Siha和CaSki，用Real time RT-PCR檢測(cè)RAB11FIP1 mRNA表達(dá)，用Westen Blot檢測(cè)RAB11FIP1蛋白表達(dá)。利用雙熒光素酶報(bào)告基因的方法確認(rèn)mi

10、R-93與RAB11FIP1的靶向關(guān)系。同時(shí)在宮頸癌細(xì)胞株Siha和CaSki中，利用慢病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)過表達(dá)RAB11FIP1蛋白，利用MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力，流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞的凋亡。用免疫組化的方法在宮頸組織中檢測(cè)RAB11FIP1蛋白表達(dá)。
　　結(jié)果：⑴抑制miR-93的表達(dá)上調(diào)宮頸癌細(xì)胞RAB11FIP1蛋白水平。⑵miR-93與含RAB11FIP13'UTR區(qū)的雙熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染，下調(diào)熒光素酶的活性，而不影響3'

11、UTR區(qū)突變報(bào)告質(zhì)粒的熒光素酶活性。⑶在宮頸癌細(xì)胞中，上調(diào)RAB11FIP1蛋白的表達(dá)抑制Siha和CaSki細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞的凋亡。⑷在宮頸癌及高級(jí)別CIN組織中，RAB11FIP1蛋白低表達(dá)，且miR-93表達(dá)與RAB11FIP1蛋白水平呈負(fù)相關(guān)，但與宮頸癌不良預(yù)后相關(guān)因素?zé)o關(guān)。
　　結(jié)論：①RAB11FIP1是miR-93的直接靶基因，miR-93通過靶向RAB11FIP1調(diào)控宮頸癌細(xì)胞的生物學(xué)功能。②上調(diào)RAB11FIP