大黃單體降低血管內皮細胞通透性及信號轉導機制.pdf

1、血管內皮最基本的功能是對液體、蛋白質和細胞維持有效的選擇性屏障，同時允許高效的氣體彌散和電解質、炎性細胞的轉運。
　　在前期研究工作中我們采用萃取技術粗提大黃，再利用色譜方法對大黃粗提物進行分離，得到了21個單體化合物。在此基礎上，本研究利用Transwell小室建立單層人臍靜脈內皮細胞（Human Umbilical Vein Endothelial Cell，HUVEC）模型，檢測大黃單體對單層HUVEC的通透性影響;以及對H

2、UVEC增殖的作用和內皮細胞鈣粘蛋白脫落的影響，挑選出大黃的有效單體。再應用實時定量PCR，Western blot以及免疫熒光方法檢測大黃單體對血管內皮細胞鈣粘蛋白:VE-cadherin和緊密連接蛋白:ZO-1，Occludin，Claudin-5的基因和蛋白表達以及細胞形態(tài)和蛋白表達強度的影響。最后通過檢測Akt的磷酸化，Rac1的活化，肌球蛋白輕鏈(Myosin Light Chain，MLC)的磷酸化水平和VE-cadheri

3、n的蛋白表達強度來闡明大黃單體是否通過PI3K/Akt信號通路對Rac1進行調控，繼而對細胞粘附連接蛋白及肌球蛋白磷酸化的調節(jié)作用來保護血管內皮屏障的信號轉導機制。
　　第一部分 大黃單體對單層血管內皮細胞通透性及增殖的影響
　　目的:檢測大黃單體對單層HUVEC的通透性影響，以及對HUVEC增殖的作用和內皮細胞鈣粘蛋白脫落的影響，挑選出大黃的有效單體并闡釋其可能的作用機理。
　　方法:采用人臍靜脈內皮細胞，用Tran

4、swell小室建立單層HUVEC模型，隨機分為正常對照組，MMP9組，21種大黃單體組，地塞米松組。其中大黃單體組再隨分為1、10、50μmol/L三個亞組。MMP9組，大黃單體組，地塞米松組首先按照lmg/L終濃度在細胞培養(yǎng)液中加入MMP9刺激。大黃單體組同時給予大黃單體干預，21種大黃單體的終濃度分別為1、10、50μmol/L;地塞米松組同時給予10μmol/L的地塞米松干預;正常對照組按照MMP9組的加藥體積，加入等量PBS作為

5、陰性對照。各組加藥完畢，于37℃、5％CO2細胞孵育箱繼續(xù)培養(yǎng)24小時。用熒光光譜儀測量通過單層HUVEC異硫氰酸熒光素標記的葡聚糖(fluorescence ofendocytosedfluorescein isothiocyanate(FITC)-dextran，F(xiàn)D40)的熒光強度反應前者通透性大小;HUVEC的增殖和細胞培養(yǎng)上清液鈣粘蛋白的濃度分別用MTT和elisa方法檢測。
　　結果:(1)與正常對照組比較，MMP9顯

6、著增加了單層HUVEC的通透性(P＜0.05);而地塞米松和1μmol/L的大黃單體:大黃酸、3，8-二羥-1-甲基蒽醌-2-羧基酸、1-O-咖啡?；?2-（4-羥基-O-肉桂酰）-β-D-葡萄糖、胡蘿卜苷亞油酸酯和大黃素及其混合物都顯著改善了MMP9損傷的單層血管內皮細胞通透性（P＜0.05）。(2)1μmol/L作用濃度的上述5種單體混合后促進了HUVEC的增殖，增殖率為6.6％;而濃度為10、50μmol/L的混合單體抑制了HUV

7、EC的增殖，抑制率分別為7.9％和13％。(3) MMP9刺激后Transwell小室上、下層細胞培養(yǎng)液VE-cadherin蛋白濃度均顯著升高，而用5種單體及其混合物（1μmol/L）或者DEX（10μmol/L）與MMP9共同干預后VE-cadherin蛋白濃度明顯降低。
　　結論:大黃單體:大黃酸、3，8-二羥-1-甲基蒽醌-2-羧基酸、1-O-咖啡?；?2-(4-羥基-O-肉桂酰)-β-D-葡萄糖、胡蘿卜苷亞油酸酯、大黃素

8、通過促進HUVEC的增殖和減少胞外VE-cadherin的脫落改善了MMP9損傷的單層HUVEC的通透性。
　　第二部分 大黃單體對MMP9損傷的血管內皮細胞連接蛋白的保護作用
　　目的:觀察大黃單體對MMP9損傷的人臍靜脈血管內皮細胞(HUVEC)鈣粘蛋白:VE-cadherin，緊密連接蛋白:ZO-1，Occludin，Claudin-5表達的影響。
　　方法:采用人臍靜脈內皮細胞，建立單層HUVEC模型，隨機分為

9、4組:Control組、MMP9組、MMP9+大黃單體混合物(monomer mixture，MM)治療組(MMP9+MM組)、MMP9+地塞米松治療組（MMP9+DEX組）;其中MMP9組按1mg/L終濃度加入MMP9刺激;MMP9+MM組在給予1mg/L的MMP9刺激的同時給予大黃5種單體干預:大黃酸，大黃素，3，8-二羥-1-甲基蒽醌-2-羧基酸，1-O-咖啡?；?2-（4-羥基-O-肉桂酰）-β-D-葡萄糖，胡蘿卜苷亞油酸酯，每

10、個單體作用的終濃度都是1 mol/L;MMP9+DEX組:按1mg/L終濃度加入MMP9刺激的同時給予10μmol/L的地塞米松治療。Control組:按照MMP9組的加藥體積，加入等量PBS代替藥物作為陰性對照。繼續(xù)培養(yǎng)24小時后，分別用實時定量PCR方法和Western blot方法檢測鈣粘蛋白:VE-cadherin，緊密連接蛋白:ZO-1，Occludin，Claudin-5的基因表達和蛋白表達，用免疫熒光方法檢測血管內皮細胞的

11、形態(tài)和上述連接蛋白的表達位置及強度。
　　結果:(1)給予MMP9刺激以后，HUVEC鈣粘蛋白:VE-cadherin，緊密連接蛋白:ZO-1，Occludin，Claudin-5的基因表達較Control組均有不同程度下降(P＜0.001)，其中VE-cadherin下降最明顯。用MM或DEX和MMP9共同孵育下，上述4種連接蛋白的基因表達水平較MMP9組明顯升高（P＜0.001）。同時MMP9+MM組明顯高于MMP+DEX組(

12、P＜0.001)。(2) MMP9刺激導致鈣粘蛋白:VE-cadherin，緊密連接蛋白:ZO-1，Occludin，Claudin-5的蛋白表達明顯下降，與control組，MMP9+MM組和MMP9+DEX組比較有顯著差異(P＜0.001)。MMP9刺激的同時再用MM干預上述4種連接蛋白的蛋白表達水平比用DEX干預明顯升高。(3)正常組細胞形態(tài)規(guī)則、胞膜完整，綠色熒光標記的連接蛋白顆粒連續(xù)、結構清晰;MMP9刺激后連接蛋白的熒光顆粒

13、顯著減少，斷裂，細胞形態(tài)結構模糊不清;而給予MMP刺激的同時用大黃單體或地塞米松干預后上述情況得到改善。
　　結論:大黃酸、3，8-二羥-1-甲基蒽醌-2-羧基酸、1-O-咖啡?；?2-（4-羥基-O-肉桂酰）-β-D-葡萄糖、胡蘿卜苷亞油酸酯和大黃素五種單體能夠升高內皮細胞的粘附連接蛋白和緊密連接蛋白的基因和蛋白表達，保護內皮細胞的形態(tài)和細胞間連接結構。
　　第三部分 大黃單體混合物改善血管內皮通透性的信號轉導機制

14、　　目的:通過檢測大黃單體對PI3K/Akt-Rac1信號通路的影響，及肌球蛋白(Myosin light chain，MLC)磷酸化(p-MLC)的調節(jié)作用來闡釋其保護血管內皮屏障的信號轉導機制。
　　方法:建立單層臍靜脈血管內皮細胞模型，隨機分為Control組，MMP9組，大黃單體混合物(monomer mixture，MM)組，地塞米松(dexamethasone，DEX)組，PI3K抑制劑wortmannin組，Rac1

15、抑制劑組NSC23766(NSC)組共6個組。其中MMP9組、MM組、DEX組、wortmannin組和NSC組細胞培養(yǎng)液加入1mg/L的MMP9; MM組同時加入lμmol/L的大黃酸、3，8-二羥-1-甲基葸醌-2-羧基酸、1-O-咖啡?；?2-（4-羥基-O-肉桂酰）-β-D-葡萄糖、胡蘿卜苷亞油酸酯和大黃素共同干預;DEX組同時加入10μmol/L DEX; wortmannin組加入1μmol/L的wortmannin;NSC

16、組加入100μmol/L的NSC23766培養(yǎng)細胞24h。采用Rac1活性檢測試劑盒檢測Rac1的活性;Western blot方法檢測AKT，p-AKT，VE-cadherin，MLC，p-MLC的表達。
　　結果:(1)給予MMP9刺激以后Akt磷酸化(p-Akt)水平較正常對照組明顯增高(P＜0.001)，給予MM、DEX或wortmannin干預后，能顯著降低p-Akt（P＜0.01）。但較正常對照組仍有一定程度的增高（P

17、＜0.01）。(2) MMP9組較正常組明顯促進了Rac1的活性(P＜0.001);應用MM、DEX或NSC干預均能降低Rac1的活性(P＜0.01)。同時VE-cadherin的蛋白表達量增加，與MMP9組比較(P＜0.05)。(3)MMP9刺激后MLC磷酸化水平較正常對照組明顯增高（P＜0.001），給予MM或DEX干預顯著降低p-MLC(P＜0.01)。但較正常對照組仍有一定程度的增高(P＜0.01)。
　　結論:大黃酸、3