大豆根部內(nèi)生放線菌的篩選、鑒定及其活性代謝產(chǎn)物研究.pdf

1、大豆疫霉根腐病是由大豆疫霉引起的全球性大豆病害。而在某些大豆疫霉發(fā)病的大田中會發(fā)現(xiàn)在已發(fā)病的植株鄰近會有健康成活的植株。這一現(xiàn)象是否與植物內(nèi)生放線菌協(xié)助植物抗病有關(guān)？因此本研究以這種健康大豆植株的根部作為分離對象，進行內(nèi)生放線菌分離。對已篩選的菌株進行新屬、種鑒定及抗大豆疫霉活性評估，并利用活性追蹤的方法對其活性代謝產(chǎn)物進行了研究，結(jié)果如下:
　　 (1)從健康的大豆根部分離得到內(nèi)生放線菌29株，其中包括鏈霉菌屬19株，小單孢菌

2、屬7株，鏈孢囊菌屬1株，野野村氏菌屬1株和王氏放線菌屬1株。
　　 (2)利用多相性分類對菌株NEAU-J3進行分類學鑒定。16S rRNA基因序列分析顯示該菌屬于小單孢菌科。菌株NEAU-J3細胞壁氨基酸為內(nèi)消旋二氨基庚二酸，細胞水解糖為半乳糖、核糖和葡萄糖，醌組主要為MK-9(H4)和MK-9(H6)，磷酸類脂為磷脂酰膽堿和磷脂酰乙醇胺，脂肪酸主要為C16∶0，C18∶1ω9c，C18∶0，C17∶0，C17∶1ω7c，an

3、teiso-C17∶0，C16∶1ω7c和C15∶0，基因組G+C mol％為62.5mol％。通過形態(tài)特征、化學分類學分析、系統(tǒng)分類學分析及16S rRNA特征性核苷酸分析確定菌株NEAU-J3屬于小單孢菌科的一個新屬，命名為Wangellaharbinensis，保藏在中國科學院微生物研究所和德國不倫瑞克市德國菌種保藏中心(=CGMCC4.7039T=DSM45747T)。
　　 (3)利用多相性分類對菌株NEAU-Da3進

4、行分類學鑒定。16S rRNA基因序列分析顯示該菌屬于鏈霉菌屬。菌株NEAU-Da3與Streptomyces carpaticus NRRL B-16359T(99.5％)，Streptomyces cheonanensis VC-A46T(99.3％),Streptomyces xiamenensis MCCC1A01550T(97.2％)和Streptomyces sodiiphilus YIM80305T(97.1％)的16S

5、rRNA基因序列相似性最高，與鏈霉菌屬的其它模式菌株的相似性均低于97％。通過鄰位連接法和最大似然法將菌株NEAU-Da3與同源性高的鏈霉菌菌株構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，我們發(fā)現(xiàn)，兩種方法得到的拓撲結(jié)構(gòu)十分一致，菌株NEAU-J3與S.carpaticus NRRL B-16359T，S.cheonanensis VC-A46T及S.xiamenensis MCCC1 A01550T形成獨立分支，其所顯示高的靴值支持了這個分支。通過形態(tài)特征、生理

6、生化特性、系統(tǒng)分類學分析及DNA雜交分析確定NEAU-Da3屬于鏈霉菌的一個新種，命名為Streptomyces harbinensis，保藏在中國科學院微生物研究所和德國不倫瑞克市德國菌種保藏中心（=CGMCC4.7047T=DSM42076T）。
　　 (4)利用多相性分類對菌株NEAU-W2進行分類學鑒定。菌株NEAU-W2具有典型的鏈霉菌形態(tài)和化學分類學特征?；蚪MG+C mol％為66.12mol％。16S rRNA基

7、因序列分析顯示該菌株與其相似性最高的Streptomyces neyagawaensis ATCC27449T(99.61％)形成獨立的分支，而DNA雜交顯示它們的基因組同源性只有58.51％。此外，菌株NEAU-W2可以與S.neyagawaensis ATCC27449T及其他相似性高的鏈霉菌菌株(98-99％)以及產(chǎn)勃利霉素的其他菌株在形態(tài)和生理生化特性上進行明顯區(qū)分。通過形態(tài)特征、生理生化特性、系統(tǒng)分類學分析及DNA雜交分析確定

8、NEAU-W2屬于鏈霉菌的一個新種，命名為Streptomycesheilongjiangensis，并保藏在在中國科學院微生物研究所，美國模式培養(yǎng)物集存庫和德國不倫瑞克市德國菌種保藏中心（=CGMCC4.7004T=DSM42073T=ATCC BAA-2424T）。
　　 (5)體外活性評估實驗顯示，新種NEAU-W2具有極強的抗大豆疫霉活性。通過活性追蹤法對菌株NEAU-W2所產(chǎn)抗大豆疫霉活性化合物進行分離，并通過UV、I

9、R、1H NMR、13C NMR、ESI-MS和HRESI-MS對活性化合物的結(jié)構(gòu)進行表征，鑒定該活性化合物為勃利霉素。在對勃利霉素抗大豆疫霉活性評估時，勃利霉素對大豆疫霉1號生理小種的EC50和EC95值分別為0.0056和0.026 mg/L，該值比商品化的抗大豆疫霉藥劑甲霜靈分別低了62.5和262.3倍。研究者進一步對大豆疫霉生理小種1進行活體內(nèi)活性評估，在濃度為10mg/L時，其對大豆疫霉的防效達到了94.72％，比在同樣有效