含鹵化酶基因放線菌的篩選及其活性代謝產(chǎn)物的研究.pdf

1、鹵化化合物具有結(jié)構(gòu)的多樣性，已被廣泛應(yīng)用于工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和人類疾病防治領(lǐng)域。鹵元素的添加通?？梢栽鰪?qiáng)化合物的生物活性，但由于缺少底物的特異性和區(qū)域選擇性使得通過(guò)傳統(tǒng)化學(xué)合成的方法獲得這些鹵化物較為困難；另一方面，越來(lái)越多的研究顯示許多微生物可通過(guò)自身代謝產(chǎn)生鹵化物，這些化合物的生物合成需要鹵化酶的參與，其中FADH2依賴性的鹵化酶是最重要的一類鹵化酶。本文利用FADH2依賴性鹵化酶中的保守序列設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物通過(guò)PCR的方法進(jìn)行產(chǎn)鹵化代謝物微生

2、物的篩選，并利用活性介導(dǎo)的方法對(duì)其活性代謝產(chǎn)物進(jìn)行了研究，結(jié)果如下：
　　 （1）利用PCR的方法對(duì)從土壤中隨機(jī)分離的57株放線菌進(jìn)行了篩選，其中的10株放線菌可擴(kuò)增出具有預(yù)測(cè)大小的PCR產(chǎn)物。在這10株放線菌中，放線菌HBDN08的發(fā)酵液對(duì)枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis ATCC6633和藤黃微球菌Micrococcus luteus ATCC9341具有最為顯著的抑制活性。對(duì)該菌的PCR產(chǎn)物（halA）的序列

3、（GenBank登錄號(hào)：FJ875940）分析表明，其核苷酸序列與Burkholderia cepacin、Burholderia pyrrocinia和.Pseudomonasfluorescens中的色氨酸鹵化酶（PrnA）基因（GenBank登錄號(hào)分別為AF161183、AF161186和AF161184）的序列同源性大于90％。氨基酸序列分析顯示，HalA與Lechevalieriaaerocolonigenes來(lái)源的色氨酸-7

4、-鹵化酶（RebH）、Pseudomonas fluorescens BL915來(lái)源的色氨酸-7-鹵化酶（PrnA）和Streptomyces rugosporus來(lái)源的色氨酸-5-鹵化酶（PyrH）的序列同源性分別為36％、38％和35％，且HalA中含有色氨酸鹵化酶中的三個(gè)保守的序列，因此，推測(cè)放線菌HBDN08可能含有潛在的鹵化酶基因，并可產(chǎn)生鹵化代謝物。16S rDNA序列（GenBank登錄號(hào)FJ770217）分析顯示HBDN

5、08屬于游動(dòng)放線菌屬，并被命名為Actinoplanessp.HBDN08，菌株已提交中國(guó)典型菌種保藏中心保藏（保藏號(hào)為CGMCC2944）。
　　 （2）對(duì)放線菌Actinoplanes sp.HBDN08發(fā)酵液中鹵化代謝產(chǎn)物進(jìn)行分離及結(jié)構(gòu)鑒定，從中得到一個(gè)新的化合物3’，8-雙氯染料木素和一個(gè)已知化合物8-氯染料木素。氯化染料木素的來(lái)源分析表明，3’，8-雙氯染料木素和8-氯染料木素來(lái)自于Actinoplanes sp.HB

6、DN08對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基中染料木素的生物轉(zhuǎn)化?？怪|(zhì)體氧化實(shí)驗(yàn)顯示，3’，8-雙氯染料木素和8-氯染料木素的抗氧化活性要強(qiáng)于染料木素，三者的IC50（半抑制濃度）分別為5.2、7.5和13.6μM。抗癌實(shí)驗(yàn)顯示，3’，8-雙氯染料木素、8-氯染料木素和染料木素對(duì)人肺腺癌細(xì)胞A549的生長(zhǎng)均具有抑制活性，其IC50分別為27.94.、20.98和23.13μg/ml；對(duì)小鼠黑色素瘤細(xì)胞B16的IC50分別為8.26、3.95和4.96μg/m

7、l，這表明染料木素8位的氯化對(duì)染料木素抑制人肺腺癌細(xì)胞A549和小鼠黑色素瘤細(xì)胞B16生長(zhǎng)的活性影響不大，但3’和8位同時(shí)氯化可導(dǎo)致染料木素對(duì)這兩種細(xì)胞的抑制活性明顯降低。與之相反，氯化可顯著增強(qiáng)染料木素對(duì)人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231的生長(zhǎng)抑制活性，3’，8-雙氯染料木素、8-氯染料木素和染料木素對(duì)該細(xì)胞系的IC50分別為3.15、7.2和19.24μg/ml；與染料木素相比，3’，8-雙氯染料木素和8-氯染料木素的抗癌活性分別提高

8、了6.1和2.7倍。雖然放線菌Actinoplanes Sp.HBDN08的發(fā)酵液上清對(duì)枯草芽孢桿菌和藤黃微球菌具有明顯的抑制活性，但當(dāng)上清液于45℃處理1 h后可導(dǎo)致該抗菌活性喪失，這種情況與氯化的糖苷肽類抗生物萬(wàn)古霉素和替考拉寧極為相似，關(guān)于發(fā)酵液上清中的活性物質(zhì)的提取還在進(jìn)一步的研究之中。
　　 （3）利用現(xiàn)代波譜技術(shù)（紫外、熒光、圓二色）和分子對(duì)接的方法研究了3’，8-雙氯染料木素與牛血清白蛋白（BSA）的相互作用機(jī)制。

9、結(jié)果表明，3’，8-雙氯染料木素對(duì)BSA的熒光猝滅為靜態(tài)猝滅，其在BSA上只有一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。在溫度為300 K時(shí)，3’，8-雙氯染料木素的結(jié)合常數(shù)為2.07×105M-1，與染料木素相比，3’，8-雙氯染料木素與BSA的結(jié)合力更強(qiáng)。熱力學(xué)常數(shù)△G<0，△H=-11.64 kJ mol-1，△S=137.70 J mol-1 K-1，這說(shuō)明3’，8-雙氯染料木素與BSA的結(jié)合反應(yīng)是一個(gè)自發(fā)的過(guò)程，主要作用力是疏水和靜電作用。利用大豆苷元進(jìn)

10、行的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合實(shí)驗(yàn)表明，3’，8-雙氯染料木素在BSA上的結(jié)合位點(diǎn)位于ⅡA亞結(jié)構(gòu)域的site I。根據(jù)Forster非輻射能量轉(zhuǎn)移理論，求出3’，8-雙氯染料木素與BSA之間的結(jié)合距離為r=4.59nm。通過(guò)同步熒光光譜法、三維熒光光譜法、紫外可見(jiàn)光譜法和圓二色光譜法研究了牛血清白蛋白與3’，8-雙氯染料木素結(jié)合前后，蛋白質(zhì)微環(huán)境及構(gòu)型的改變。結(jié)果表明，3’，8-雙氯染料木素與BSA的結(jié)合可導(dǎo)致BSA中a-螺旋含量的降低，從而引起蛋白質(zhì)的

11、構(gòu)象發(fā)生改變。分子對(duì)接實(shí)驗(yàn)顯示，3’，8-雙氯染料木素的結(jié)合位點(diǎn)位于BSA的疏水洞穴中，這與其它光譜技術(shù)的研究結(jié)果一致，同時(shí)還揭示3’，8-雙氯染料木素與BSA的結(jié)合常數(shù)高于染料木素與BSA的結(jié)合常數(shù)的原因可能是3’位的氯原子與BSA中的Asp450間形成了鹵鍵。3’，8-雙氯染料木素與BSA的結(jié)合機(jī)制將有助于染料木素結(jié)構(gòu)類似物的藥物的設(shè)計(jì)與開(kāi)發(fā)，對(duì)指導(dǎo)臨床用藥和藥物代謝動(dòng)力學(xué)具有十分重要的作用。
　　 （4）體外及活體初篩實(shí)驗(yàn)

12、顯示，放線菌Actinoplanes sp.HBDN08可產(chǎn)生抗真菌代謝物，這種代謝產(chǎn)物主要產(chǎn)生于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)末期和穩(wěn)定期。利用這種活性介導(dǎo)的方法以及波譜學(xué)分析表明，具有抗真菌活性的代謝物為5-羥基-5-甲基-2-己烯酸。體外實(shí)驗(yàn)顯示，該化合物對(duì)黃瓜灰霉病源菌、黃瓜黑星病源菌和黃瓜黑斑病源菌具有明顯的抑制活性，其IC50分別為分別為32.45、27.17和30.66 mg/L，而對(duì)水稻紋枯病源菌具有稍弱的抑制活性（IC50=61.64 mg

13、/L）。IC50和MFC（最小殺菌濃度）的對(duì)照表明，5-羥基-5-甲基-2-己烯酸對(duì)以上病源菌具有較強(qiáng)的抑制活性，但殺菌活性則較弱。盆栽活體實(shí)驗(yàn)顯示，5-羥基-5-甲基-2-己烯酸可有效防治黃瓜灰霉病源菌、黃瓜黑星病源菌和黃瓜黑斑病源菌的發(fā)生，在濃度為350 mg/L時(shí)，其防治效果分別為71.42％，78.63％和65.13％，在該濃度下的防治效果稍低于商品化殺真菌劑唑菌酯在250 mg幾濃度時(shí)的防治效果。本文第一次報(bào)道了5-羥基-5-