2023年全國(guó)碩士研究生考試考研英語(yǔ)一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁(yè)
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1、鹵化化合物具有結(jié)構(gòu)的多樣性,已被廣泛應(yīng)用于工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和人類疾病防治領(lǐng)域。鹵元素的添加通??梢栽鰪?qiáng)化合物的生物活性,但由于缺少底物的特異性和區(qū)域選擇性使得通過(guò)傳統(tǒng)化學(xué)合成的方法獲得這些鹵化物較為困難;另一方面,越來(lái)越多的研究顯示許多微生物可通過(guò)自身代謝產(chǎn)生鹵化物,這些化合物的生物合成需要鹵化酶的參與,其中FADH2依賴性的鹵化酶是最重要的一類鹵化酶。本文利用FADH2依賴性鹵化酶中的保守序列設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物通過(guò)PCR的方法進(jìn)行產(chǎn)鹵化代謝物微生

2、物的篩選,并利用活性介導(dǎo)的方法對(duì)其活性代謝產(chǎn)物進(jìn)行了研究,結(jié)果如下:
   (1)利用PCR的方法對(duì)從土壤中隨機(jī)分離的57株放線菌進(jìn)行了篩選,其中的10株放線菌可擴(kuò)增出具有預(yù)測(cè)大小的PCR產(chǎn)物。在這10株放線菌中,放線菌HBDN08的發(fā)酵液對(duì)枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis ATCC6633和藤黃微球菌Micrococcus luteus ATCC9341具有最為顯著的抑制活性。對(duì)該菌的PCR產(chǎn)物(halA)的序列

3、(GenBank登錄號(hào):FJ875940)分析表明,其核苷酸序列與Burkholderia cepacin、Burholderia pyrrocinia和.Pseudomonasfluorescens中的色氨酸鹵化酶(PrnA)基因(GenBank登錄號(hào)分別為AF161183、AF161186和AF161184)的序列同源性大于90%。氨基酸序列分析顯示,HalA與Lechevalieriaaerocolonigenes來(lái)源的色氨酸-7

4、-鹵化酶(RebH)、Pseudomonas fluorescens BL915來(lái)源的色氨酸-7-鹵化酶(PrnA)和Streptomyces rugosporus來(lái)源的色氨酸-5-鹵化酶(PyrH)的序列同源性分別為36%、38%和35%,且HalA中含有色氨酸鹵化酶中的三個(gè)保守的序列,因此,推測(cè)放線菌HBDN08可能含有潛在的鹵化酶基因,并可產(chǎn)生鹵化代謝物。16S rDNA序列(GenBank登錄號(hào)FJ770217)分析顯示HBDN

5、08屬于游動(dòng)放線菌屬,并被命名為Actinoplanessp.HBDN08,菌株已提交中國(guó)典型菌種保藏中心保藏(保藏號(hào)為CGMCC2944)。
   (2)對(duì)放線菌Actinoplanes sp.HBDN08發(fā)酵液中鹵化代謝產(chǎn)物進(jìn)行分離及結(jié)構(gòu)鑒定,從中得到一個(gè)新的化合物3’,8-雙氯染料木素和一個(gè)已知化合物8-氯染料木素。氯化染料木素的來(lái)源分析表明,3’,8-雙氯染料木素和8-氯染料木素來(lái)自于Actinoplanes sp.HB

6、DN08對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基中染料木素的生物轉(zhuǎn)化??怪|(zhì)體氧化實(shí)驗(yàn)顯示,3’,8-雙氯染料木素和8-氯染料木素的抗氧化活性要強(qiáng)于染料木素,三者的IC50(半抑制濃度)分別為5.2、7.5和13.6μM。抗癌實(shí)驗(yàn)顯示,3’,8-雙氯染料木素、8-氯染料木素和染料木素對(duì)人肺腺癌細(xì)胞A549的生長(zhǎng)均具有抑制活性,其IC50分別為27.94.、20.98和23.13μg/ml;對(duì)小鼠黑色素瘤細(xì)胞B16的IC50分別為8.26、3.95和4.96μg/m

7、l,這表明染料木素8位的氯化對(duì)染料木素抑制人肺腺癌細(xì)胞A549和小鼠黑色素瘤細(xì)胞B16生長(zhǎng)的活性影響不大,但3’和8位同時(shí)氯化可導(dǎo)致染料木素對(duì)這兩種細(xì)胞的抑制活性明顯降低。與之相反,氯化可顯著增強(qiáng)染料木素對(duì)人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231的生長(zhǎng)抑制活性,3’,8-雙氯染料木素、8-氯染料木素和染料木素對(duì)該細(xì)胞系的IC50分別為3.15、7.2和19.24μg/ml;與染料木素相比,3’,8-雙氯染料木素和8-氯染料木素的抗癌活性分別提高

8、了6.1和2.7倍。雖然放線菌Actinoplanes Sp.HBDN08的發(fā)酵液上清對(duì)枯草芽孢桿菌和藤黃微球菌具有明顯的抑制活性,但當(dāng)上清液于45℃處理1 h后可導(dǎo)致該抗菌活性喪失,這種情況與氯化的糖苷肽類抗生物萬(wàn)古霉素和替考拉寧極為相似,關(guān)于發(fā)酵液上清中的活性物質(zhì)的提取還在進(jìn)一步的研究之中。
   (3)利用現(xiàn)代波譜技術(shù)(紫外、熒光、圓二色)和分子對(duì)接的方法研究了3’,8-雙氯染料木素與牛血清白蛋白(BSA)的相互作用機(jī)制。

9、結(jié)果表明,3’,8-雙氯染料木素對(duì)BSA的熒光猝滅為靜態(tài)猝滅,其在BSA上只有一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。在溫度為300 K時(shí),3’,8-雙氯染料木素的結(jié)合常數(shù)為2.07×105M-1,與染料木素相比,3’,8-雙氯染料木素與BSA的結(jié)合力更強(qiáng)。熱力學(xué)常數(shù)△G<0,△H=-11.64 kJ mol-1,△S=137.70 J mol-1 K-1,這說(shuō)明3’,8-雙氯染料木素與BSA的結(jié)合反應(yīng)是一個(gè)自發(fā)的過(guò)程,主要作用力是疏水和靜電作用。利用大豆苷元進(jìn)

10、行的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合實(shí)驗(yàn)表明,3’,8-雙氯染料木素在BSA上的結(jié)合位點(diǎn)位于ⅡA亞結(jié)構(gòu)域的site I。根據(jù)Forster非輻射能量轉(zhuǎn)移理論,求出3’,8-雙氯染料木素與BSA之間的結(jié)合距離為r=4.59nm。通過(guò)同步熒光光譜法、三維熒光光譜法、紫外可見(jiàn)光譜法和圓二色光譜法研究了牛血清白蛋白與3’,8-雙氯染料木素結(jié)合前后,蛋白質(zhì)微環(huán)境及構(gòu)型的改變。結(jié)果表明,3’,8-雙氯染料木素與BSA的結(jié)合可導(dǎo)致BSA中a-螺旋含量的降低,從而引起蛋白質(zhì)的

11、構(gòu)象發(fā)生改變。分子對(duì)接實(shí)驗(yàn)顯示,3’,8-雙氯染料木素的結(jié)合位點(diǎn)位于BSA的疏水洞穴中,這與其它光譜技術(shù)的研究結(jié)果一致,同時(shí)還揭示3’,8-雙氯染料木素與BSA的結(jié)合常數(shù)高于染料木素與BSA的結(jié)合常數(shù)的原因可能是3’位的氯原子與BSA中的Asp450間形成了鹵鍵。3’,8-雙氯染料木素與BSA的結(jié)合機(jī)制將有助于染料木素結(jié)構(gòu)類似物的藥物的設(shè)計(jì)與開(kāi)發(fā),對(duì)指導(dǎo)臨床用藥和藥物代謝動(dòng)力學(xué)具有十分重要的作用。
   (4)體外及活體初篩實(shí)驗(yàn)

12、顯示,放線菌Actinoplanes sp.HBDN08可產(chǎn)生抗真菌代謝物,這種代謝產(chǎn)物主要產(chǎn)生于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)末期和穩(wěn)定期。利用這種活性介導(dǎo)的方法以及波譜學(xué)分析表明,具有抗真菌活性的代謝物為5-羥基-5-甲基-2-己烯酸。體外實(shí)驗(yàn)顯示,該化合物對(duì)黃瓜灰霉病源菌、黃瓜黑星病源菌和黃瓜黑斑病源菌具有明顯的抑制活性,其IC50分別為分別為32.45、27.17和30.66 mg/L,而對(duì)水稻紋枯病源菌具有稍弱的抑制活性(IC50=61.64 mg

13、/L)。IC50和MFC(最小殺菌濃度)的對(duì)照表明,5-羥基-5-甲基-2-己烯酸對(duì)以上病源菌具有較強(qiáng)的抑制活性,但殺菌活性則較弱。盆栽活體實(shí)驗(yàn)顯示,5-羥基-5-甲基-2-己烯酸可有效防治黃瓜灰霉病源菌、黃瓜黑星病源菌和黃瓜黑斑病源菌的發(fā)生,在濃度為350 mg/L時(shí),其防治效果分別為71.42%,78.63%和65.13%,在該濃度下的防治效果稍低于商品化殺真菌劑唑菌酯在250 mg幾濃度時(shí)的防治效果。本文第一次報(bào)道了5-羥基-5-

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