高Lys蛋白基因和高Met蛋白基因在枯草芽孢桿菌中的共表達.pdf

1、賴氨酸與蛋氨酸均為畜禽的限制性必需氨基酸，其飼料含量直接影響到畜禽蛋白質的合成。本研究旨在通過基因工程手段構建兩個表達載體（含高賴氨酸蛋白基因的表達載體和含高蛋氨酸蛋白基因的表達載體），使辣椒花藥中高賴氨酸蛋白基因（Cflr）和玉米胚乳中高蛋氨酸基因（zein）在枯草芽孢桿菌中共同表達，建立高賴氨酸蛋白基因和高蛋氨酸蛋白基因在微生物中共表達的轉基因技術，為將含有高賴氨酸蛋白基因和高蛋氨酸蛋白基因的益生菌應用于奶牛生產提供技術基礎。

2、>　　 本實驗從辣椒花藥中提取總RNA，反轉錄獲得cDNA，以此cDNA為模板，根據高賴氨酸蛋白基因的基因序列和枯草芽孢桿菌表達載體pHT43的多克隆酶切位點設計兩對引物，通過PCR擴增出目的基因片段，獲得長為720bp的Cflr的DNA片段，與預期的目的片段大小一致。將辣椒花藥高賴氨酸蛋白基因(Cflr)片段克隆到pMD18-T載體上，經PCR鑒定出的陽性克隆進行測序，將測序結果與NCBI上報道Cflr的cDNA全序列基因(基因登錄

3、號:EU367999)進行同源性比較、分析，結果同源性為99％。
　　 本實驗從新鮮的玉米胚乳中提取RNA，反轉錄獲得cDNA，以此cDNA為模板，根據高蛋氨酸蛋白基因的基因序列和枯草芽孢桿菌表達載體pHT43的多克隆酶切位點設計兩對引物，通過PCR擴增出目的基因片段，獲得長為476bp的zein的DNA片段，與預期的目的片段大小一致。將玉米醇溶蛋白基因（zein）片段克隆到pMD18-T載體上，經PCR鑒定出的陽性克隆進行測序

4、，將測序結果與NCBI上報道zein的cDNA全序列基因(基因登錄號為:541922 dzs10)進行同源性比較、分析，結果同源性為99％。
　　 將測序成功的PCR產物Cflr基因片段通過酶切位點連接到原核表達載體pHT43上，轉入大腸桿菌TOP10中，經質粒PCR和XbaⅠ+SmaⅠ雙酶切鑒定，篩選陽性重組子，構建成枯草芽孢桿菌原核表達質粒pHT43/Cflr;再將測序成功的PCR產物zein基因片段通過酶切位點連接到原核表

5、達載體pHT43上，轉入大腸桿菌TOP10中，經質粒PCR和XbaⅠ+SmaⅠ雙酶切鑒定，篩選陽性重組子，構建成枯草芽孢桿菌原核表達質粒pHT43/zein。通過化學轉化法首先將原核表達質粒pHT43/Cflr轉入野生型枯草芽孢桿菌168中，然后再將原核表達質粒pHT43/zein轉入含有質粒pHT43/Cflr的枯草芽孢桿菌中。經過菌液PCR和測序等篩選出陽性重組克隆，構建成含有高Lys蛋白基因和高Met蛋白基因的枯草芽孢桿菌168重

6、組菌。
　　 重組菌經IPTG誘導，分別在mRNA水平和蛋白水平上檢測到Cflr和zein基因的表達情況。通過qRT-PCR方法證明Cflr和zein基因在枯草芽孢桿菌中有mRNA水平的表達;通過SDS-PAGE方法可以證明Cflr和zein基因在枯草芽孢桿菌中有蛋白水平的表達，SDS-PAGE中出現兩條明顯的目的蛋白條帶，一條大小為24kD，另一條大小為16kD。經HPLC檢測重組菌發(fā)酵菌液的賴氨酸含量比野生型菌株菌液提高了1