PITX2基因多態(tài)性與先天性心臟病相關(guān)研究.pdf

1、目的：本課題的研究重點(diǎn)是應(yīng)用生物信息學(xué)的研究方法與研究工具，對與CHD相關(guān)的PITX2基因c亞型的編碼區(qū)SNPs進(jìn)行分析、篩選，確定可能影響基因功能的SNPs位點(diǎn)。進(jìn)而在CHD與健康對照人群中用實驗的方法對所得SNPs位點(diǎn)予以驗證，探討其與中國人群CHD的相關(guān)性，為預(yù)防和減少CHD的發(fā)生及制定CHD防治對策提供科學(xué)理論依據(jù)。
　　 方法：⑴利用NCBI網(wǎng)站SNPs數(shù)據(jù)庫查找PITX2基因c亞型編碼區(qū)所有SNPs，同時運(yùn)用在線生物

2、信息學(xué)工具SNPper軟件查找PITX2基因c亞型編碼區(qū)的非同義SNPs。比較兩種查詢結(jié)果，參考相關(guān)文獻(xiàn)，最終確定所要研究的SNPs位點(diǎn)。⑵進(jìn)行臨床數(shù)據(jù)資料和臨床標(biāo)本收集和整理。采用病例-對照研究方法，采集入組CHD患者和健康對照組患者外周血2ml，以枸櫞酸鈉抗凝，于-80℃保存?zhèn)溆?。⑶基因測序并評價SNPs位點(diǎn)和CHD的相關(guān)性。血液基因組DNA提取→引物準(zhǔn)備→PCR擴(kuò)增目的片段→PCR產(chǎn)物的鑒定→PCR產(chǎn)物測序→數(shù)據(jù)分析。運(yùn)用SPSS

3、17.0軟件進(jìn)行相關(guān)數(shù)據(jù)分析：Hardy-Weinberg遺傳平衡檢測樣本是否符合孟德爾遺傳規(guī)律；病例-對照組間SNPs位點(diǎn)等位基因頻率及基因型頻率的比較，各基因型與CHD發(fā)病危險性的關(guān)系。
　　 結(jié)果：①確定的PITX2基因2個SNPs位點(diǎn)分別為rs1051887:316G>C(Glu106Gln)，rs28936409:272G>C(Arg91Pro)。②本研究所涉及的2個SNPs，rs1051887及rs28936409，

4、在病例及對照組中均未見多態(tài)性結(jié)果。③綜合dbSNP數(shù)據(jù)庫和SNPper軟件的檢索結(jié)果，確定本實驗首次發(fā)現(xiàn)了PITX2基因的304C>G(Glu102Gln)位點(diǎn)存在C/G基因型，該SNP位于PITX2基因同源結(jié)構(gòu)域內(nèi)的外顯子5內(nèi)，mRNA序列第942位C→G，導(dǎo)致第102個氨基酸由谷氨酸(Glu，E)→谷氨酰胺(Gln，Q)，屬非同義cSNP。④數(shù)據(jù)分析結(jié)果顯示，全部3個SNPs位點(diǎn)的病例組及對照組的基因型分布經(jīng)Hardy-Weinbe

5、rg遺傳平衡檢測無差異(P>0.05)，即樣本符合孟德爾遺傳規(guī)律。⑤本研究新發(fā)現(xiàn)的PITX2基因SNP位點(diǎn)304C>G(Glu102Gln)，病例-對照研究發(fā)現(xiàn)，CHD組的CG基因型頻率高于對照組(x2=7.177，P<0.05)，且等位基因的頻率亦高于對照組(x2=5.566，P<0.05)，CG基因型的OR=2.667，所以CG基因型使CHD發(fā)生的危險度增加。⑥PITX2基因新的SNPs位點(diǎn)304C>G(Glu102Gln)，病例-

6、對照研究發(fā)現(xiàn)，間隔缺損類CHD組CG基因型頻率高于對照組(x2=6.400，P<0.05)，且等位基因的頻率亦高于對照組(x2=5.120，P<0.05)，CG基因型OR=2.778，所以CG基因型使間隔缺損類CHD發(fā)生的危險度增加。⑦PITX2基因新的SNPs位點(diǎn)304C>G(Glu102Gln)，病例-對照研究發(fā)現(xiàn)，心血管畸形類CHD組的CG基因型頻率高于對照組(x2=11.868，P<0.05)，且等位基因的頻率亦高于對照組(x2

7、=9.351，P<0.05)，CG基因型OR=4.000，所以CG基因型使血管畸形類CHD發(fā)生的危險度增加。
　　 結(jié)論：⑴通過對PITX2基因進(jìn)行生物學(xué)信息分析，綜合dbSNP數(shù)據(jù)庫和SNPper軟件的檢索結(jié)果，參考相關(guān)文獻(xiàn)，選擇位于PITX2基因外顯子5內(nèi)兩種檢索方法共有的SNPs，分別確定SNP位點(diǎn)：rs1051887:316G>C(Glu106Gln)及rs28936409：272G>C(Arg91Pro)，并將其作為本

8、組研究的PITX2基因的SNPs。⑵選定的2個SNPs：rs1051887:316G>C(Glu106Gln)及rs28936409:272G>C(Arg91Pro)在病例-對照組中均未見多態(tài)性結(jié)果，推測上述2個SNPs位點(diǎn)可能與本組CHD的發(fā)生無關(guān)。⑶綜合dbSNP數(shù)據(jù)庫和SNPper軟件的檢索結(jié)果，確定本研究首次發(fā)現(xiàn)存在一個新的SNP位點(diǎn)304C>G(Glu102Gln)。直接測序結(jié)果發(fā)現(xiàn)位于PITX2基因外顯子5內(nèi)，發(fā)現(xiàn)了該位點(diǎn)C