瘦素對小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)調(diào)節(jié)的研究.pdf

1、目的：通過觀察BV2小膠質(zhì)細(xì)胞系多種炎癥介質(zhì)的表達(dá)情況，研究瘦素對于小膠質(zhì)細(xì)胞免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)，并探究JAK2蛋白在瘦素調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞免疫反應(yīng)過程中的意義。
　　方法：通過體外模擬中樞系統(tǒng)中小膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)生炎癥反應(yīng)時的狀態(tài)，觀察在瘦素干預(yù)下小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥因子表達(dá)情況，實驗首先通過 CCK-8比色法檢測不同濃度的脂多糖（LPS）對于BV2小膠質(zhì)細(xì)胞增殖率的影響，以選擇出本實驗中LPS的適合濃度，再將 BV2小膠質(zhì)細(xì)胞按完全隨機(jī)的方法分成

2、5個小組，每個小組中包含8小瓶培養(yǎng)的BV2小膠質(zhì)細(xì)胞，根據(jù)不同的處理方法將這5個小組的小膠質(zhì)細(xì)胞分別設(shè)置為：A組為空白對照組、B組為脂多糖組、C組為瘦素組、D組為脂多糖+瘦素組、E組為瘦素+AG490組。分組后將這5組小膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行相應(yīng)處理24h后，采用流式細(xì)胞技術(shù)（FCM）檢測小膠質(zhì)細(xì)胞表面膜分子激活指標(biāo)白細(xì)胞共同抗原 CD45、黏附轉(zhuǎn)移指標(biāo)白細(xì)胞共同抗原 CD54、增殖指標(biāo)核抗原Ki-67的表達(dá)情況。以及利用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)

3、（RT-PCR）檢測小膠質(zhì)細(xì)胞凋亡蛋白基因（FasL）、一氧化氮合酶基因（iNOS）、腫瘤壞死因子基因（TNF-α）三種mRNA片段的表達(dá)情況。
　　結(jié)果：
　　采用CCK-8比色法檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與空白對照組相比，BV2小膠質(zhì)細(xì)胞在不同劑量的LPS（100ng/ml、500ng/ml、1μg/ml、5μg/ml、10μg/ml）處理培養(yǎng)24h后，BV2小膠質(zhì)細(xì)胞活性呈劑量依賴性降低，5μg/ml和10μg/ml脂多糖對于BV

4、2小膠質(zhì)細(xì)胞活性有明顯抑制作用，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），而其他三種不同濃度劑量的LPS（100ng/ml、500ng/ml、1μg/ml）對于BV2小膠質(zhì)細(xì)胞活性無明顯抑制作用，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。
　　采用FCM技術(shù)檢測結(jié)果顯示，脂多糖組和瘦素組的白細(xì)胞共同抗原CD45和CD54表達(dá)量較空白對照組有明顯升高，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），瘦素和脂多糖一樣都可以刺激小膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生炎性因子。而

5、脂多糖+瘦素組的白細(xì)胞共同抗原 CD45和 CD54表達(dá)量較脂多糖組有明顯下降，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），瘦素降低了脂多糖對于小膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生炎性因子的刺激作用。瘦素+AG490組較瘦素組白細(xì)胞共同抗原CD45和CD54表達(dá)量有所降低，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），實驗結(jié)果顯示JAK2蛋白的特異性阻斷劑AG490阻斷了瘦素對于小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥介質(zhì)白細(xì)胞共同抗原CD45和CD54的表達(dá)。而5組中增殖指標(biāo)核抗原Ki-67的表

6、達(dá)量在各組間顯示無明顯差異。
　　采用 RT-PCR技術(shù)檢測結(jié)果顯示，脂多糖組和瘦素組的細(xì)胞凋亡蛋白基因（FasL）、一氧化氮合酶基因（iNOS）、腫瘤壞死因子基因（TNF-α）三種mRNA表達(dá)量較空白對照組都有明顯升高，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），實驗結(jié)果顯示瘦素同脂多糖一樣可以刺激小膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生免疫應(yīng)答反應(yīng)并刺激炎癥基因的增值表達(dá)。脂多糖+瘦素組的細(xì)胞凋亡蛋白基因（FasL）、一氧化氮合酶基因（iNOS）、腫瘤壞死因

7、子基因（TNF-α）三種mRAN表達(dá)量較脂多糖組有明顯下降，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），實驗結(jié)果顯示瘦素降低了脂多糖對于小膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生免疫應(yīng)答反應(yīng)并刺激炎癥基因的增值表達(dá)。瘦素+AG490組較瘦素組細(xì)胞凋亡蛋白基因（FasL）、一氧化氮合酶基因（iNOS）、腫瘤壞死因子基因（TNF-α）三種 mRNA表達(dá)量有所降低，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），表明 JAK2蛋白的特異性阻斷劑 AG490阻斷了瘦素對于小膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生免

8、疫應(yīng)答反應(yīng)。
　　結(jié)論：瘦素作用于不同狀態(tài)的小膠質(zhì)細(xì)胞表現(xiàn)的作用不同，瘦素可以激活靜息狀態(tài)的小膠質(zhì)細(xì)胞使其產(chǎn)生炎性反應(yīng)，而且瘦素能夠抑制脂多糖活化后的小膠質(zhì)細(xì)胞。本次實驗表明了，一方面瘦素能夠刺激小膠質(zhì)細(xì)胞活化，另一方面瘦素又能使脂多糖活化的小膠質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)歸到靜息狀態(tài)。瘦素能夠刺激小膠質(zhì)細(xì)胞，讓小膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生多種炎性因子，這一點與脂多糖的作用相似，同時瘦素又能夠使脂多糖刺激活化的小膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生的炎性因子減少。此外，實驗結(jié)果顯示JAK