金釵石斛化學成分及其應用研究.pdf

1、金釵石斛為蘭科（Orchidaceae）石斛屬植物金釵石斛Dendrobium nobile Lindl.的新鮮或干燥莖。金釵石斛為古代本草中最早能確定的石斛品種，是我國藥用石斛主流品種之一，同時也是歷版《中華人民共和國藥典》都明確收載的石斛品種，是歷代公認的石斛正品?，F(xiàn)代研究表明，金釵石斛含有生物堿、聯(lián)芐、芴酮、菲類、多糖等成分，具有抗腫瘤、抗衰老、增強免疫、降血糖、抗白內(nèi)障等多種藥理活性。近年來，在國家的鼎力支持下，已在浙江、云南、

2、貴州、廣西、四川等主產(chǎn)區(qū)，大力發(fā)展金釵石斛的人工種植。金釵石斛在生物醫(yī)藥、養(yǎng)生保健領域的運用發(fā)展迅猛，以次充好、魚目混珠等現(xiàn)象也隨之出現(xiàn)。因此，加快我國金釵石斛的規(guī)范化人工種植和向產(chǎn)業(yè)化發(fā)展非常必要。本課題在科技部“十二五”科技支撐計劃項目——川產(chǎn)石斛規(guī)范化種植基地及其SOP優(yōu)化、升級研究的支持下，對金釵石斛化學成分及其應用進行研究。主要研究方法和結(jié)果如下：
　　1.不同產(chǎn)地金釵石斛化學成分對比研究：采用薄層色譜法、紫外-可見分光

3、光度法、HPLC等現(xiàn)代分析技術，對四川、云南、貴州及組織培養(yǎng)金釵石斛一年生莖、二年生莖、葉的化學成分進行對比研究，多途徑評價金釵石斛質(zhì)量。（1）不同生長年限金釵石斛莖中總生物堿、石斛堿、多糖含量差異較大，一年生莖中三者含量均高于二年生莖。柱前衍生化-高效液相色譜法分析單糖組成結(jié)果表明，金釵石斛莖多糖主要由甘露糖、葡萄糖和阿拉伯糖組成；除葡萄糖外，各單糖含量均隨生長年限增加呈負增長。而通過綜合對比薄層色譜、HPLC圖譜，發(fā)現(xiàn)不同生長年限金

4、釵石斛圖譜具有較高相似性，二年生莖色譜信息較一年生更為豐富，可能是由于二年生莖中除生物堿和多糖外的聯(lián)芐、菲類等成分較一年生豐富所致。若以提取金釵石斛生物堿、多糖為目的，可采收一年生莖。但確定金釵石斛的生長年限需要綜合考慮多指標含量、生物積累量、可持續(xù)生長、當?shù)夭墒涨闆r等多方面因素。雖然金釵石斛一年生莖中生物堿、多糖含量較二年生莖高，但二年生莖中所含聯(lián)芐等其他成分更為豐富，且二年生者產(chǎn)量較高，綜合考慮，金釵石斛生長年限以二年生較佳。該研究

5、為金釵石斛生長年限的確定提供了一定參考依據(jù)。（2）金釵石斛葉中具有與莖相似的生物堿、多糖類成分，含量略低于莖；且葉 HPLC圖譜與莖具多個相同色譜峰，與一年生莖相似性較高（相似度為0.513～0.749）。提示金釵石斛葉可能具有與莖相似的藥理活性，也具有很高的藥用價值。可為金釵石斛葉的綜合利用提供依據(jù)，對其開發(fā)起到積極的促進作用。（3）產(chǎn)地栽培環(huán)境對金釵石斛化學成分亦有較大影響?？偵飰A含量：云南普洱＞四川合江＞貴州赤水＞組織培養(yǎng)；石斛

6、堿含量：云南普洱＞四川合江＞組織培養(yǎng)＞貴州赤水；多糖含量：貴州赤水＞云南普洱＞四川合江＞組織培養(yǎng)。綜上，四川合江所產(chǎn)金釵石斛質(zhì)量亦較佳。四川合江與貴州赤水一衣帶水、山水相連，有著極其相似的地質(zhì)和氣候條件，是金釵石斛種植的理想環(huán)境。該研究對金釵石斛的規(guī)范化種植SOP及葉的開發(fā)利用起到積極的促進作用。
　　2.金釵石斛總生物堿提取純化工藝研究：采用單因素、星點設計試驗，優(yōu)化金釵石斛總生物堿微波提取和陽離子交換樹脂純化工藝。最佳工藝參數(shù)

7、：取金釵石斛藥材粉末，加入60倍量0.5％甲酸溶液，于90℃、900 W條件下微波提取15min，放冷，濾過，濾液在減壓濃縮至每毫升含原生藥0.2g；藥液調(diào)pH=4.0通過732型陽離子交換樹脂，上樣量1.5BV，2BV去離子水除雜，然后用3BV2%氨水的80%乙醇溶液進行洗脫，收集洗脫液，濃縮干燥，即得金釵石斛總生物堿。體外抗腫瘤實驗顯示，金釵石斛純化總堿20μg/ml對A549、DU145細胞的抑制率分別為37.45%、19.0%。

8、該方法可用于金釵石斛總生物堿的提取純化，具潛在工業(yè)生產(chǎn)價值，為下一步金釵石斛總生物堿的工業(yè)化生產(chǎn)提供實驗依據(jù)。
　　3.金釵石斛非生物堿類成分分離鑒定：采用硅膠柱色譜、LH-20柱色譜、制備薄層、重結(jié)晶等方法，對金釵石斛非生物堿類成分進行分離純化，共鑒定出8個化合物：毛蘭素（1）、石斛酚（2）、拖鞋狀石斛素（3）、毛蘭菲（4）、4,5-二羥基-2-甲氧基-9,10-二氫菲（5）、香豆素（6）、棕櫚酸甲酯（7）、鄰苯二甲酸二丁酯（8

9、）；其中1、3、5、6、7、8均為首次從金釵石斛中分離得到。上述分離鑒定的成分中包含兩個聯(lián)芐類、三個菲類、一個香豆素類和兩個脂肪酸類化合物，化合物1～6在鼓槌石斛、流蘇石斛或疊鞘石斛中各有分布，在豐富金釵石斛物質(zhì)基礎的同時，也為尋找金釵石斛與其他主流藥用石斛品種間化學成分的相似性提供了依據(jù)。在高效液相指紋圖譜中對化合物1～6進行色譜峰標定，為今后譜效關系的建立奠定了一定基礎。
　　4.石斛三七養(yǎng)生顆粒藥學研究：石斛三七養(yǎng)生顆粒由金

10、釵石斛、三七、巴戟天、蒺藜4味中藥組成，根據(jù)其藥效成分性質(zhì)，并結(jié)合臨床應用需要，經(jīng)多指標綜合考察篩選，確定了石斛三七養(yǎng)生顆粒的制備工藝參數(shù)。初步建立了石斛三七養(yǎng)生顆粒質(zhì)量標準，建立了石斛、三七、巴戟天薄層鑒別及總生物堿、三七皂苷R1和人參皂苷Rg1含量測定方法，對顆粒進行多指標質(zhì)量控制。對金釵石斛進行產(chǎn)品開發(fā)，擴大了金釵石斛應用范圍及適應面，增加了金釵石斛的的產(chǎn)業(yè)價值。
　　本論文為金釵石斛規(guī)范化種植SOP及葉的開發(fā)利用提供了一定

11、指導；其非生物堿類成分的分離豐富了金釵石斛的物質(zhì)基礎，并為尋找與其他藥用主流品種間化學成分的相似性提供了一定支持；金釵石斛總生物堿的提取純化工藝及石斛三七養(yǎng)生顆粒的藥學研究，為擴大金釵石斛市場應用及后續(xù)產(chǎn)品開發(fā)奠定了基礎。
　　創(chuàng)新點：
　?。?）采用星點設計-響應面優(yōu)化金釵石斛總生物堿微波提取工藝，并進行陽離子交換樹脂純化，為金釵石斛總生物堿的工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)。
　　（2）從金釵石斛中分離鑒定出8個非生物堿類化