SARS病人組織中SARS冠狀病毒全基因組克隆、序列分析及病毒樣顆粒裝配.pdf

1、2003年春季在我國(guó)廣東、北京等地人群中爆發(fā)了以高熱、寒戰(zhàn)、肌肉痛、干咳、呼吸困難、高度接觸性傳染為主要特點(diǎn)的傳染性疾病，隨后該疾病被正式命名為“嚴(yán)重急性呼吸綜合癥(簡(jiǎn)稱SARS)”。病因?qū)W研究表明，SARS的病因是一種新型冠狀病毒，世界衛(wèi)生組織將其命名為SARS相關(guān)冠狀病毒(SARS-associatedcoronavirus，SARS-CoV)。作為一種新發(fā)現(xiàn)的病毒，目前對(duì)其遺傳學(xué)和復(fù)制、裝配機(jī)制等還所知甚少，因此開展此方面研究具有

2、重要意義。 筆者參與了SARS病原的調(diào)查工作。為深入闡明北京地區(qū)流行的SARA-CoV的病原學(xué)特征，首先從SARS病人病料標(biāo)本中進(jìn)行病毒分離試驗(yàn)。將SARS病人臨床標(biāo)本，如咽拭子、痰液和肺組織標(biāo)本接種Vero細(xì)胞，連續(xù)傳代后，可觀察到顯著的細(xì)胞病理改變(CPE)，表明可能標(biāo)本中可能存在病毒。電鏡觀察分離物培養(yǎng)上清負(fù)染樣本，，可見到形態(tài)與典型冠狀病毒外觀相似的病毒樣顆粒；用SARS病人康復(fù)期血清進(jìn)行的間接免疫熒光試驗(yàn)，顯示分離物

3、接種培養(yǎng)的細(xì)胞胞漿內(nèi)存在特異性熒光，證實(shí)培養(yǎng)物中存在與SARS-CoV相關(guān)的病毒抗原；提取分離物總RNA進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)，可用冠狀病毒基因組序列特異性引物擴(kuò)增特異性片段，克隆擴(kuò)增片段后進(jìn)行DNA序列分析，結(jié)果顯示所擴(kuò)增的片段為冠狀病毒保守的復(fù)制酶基因區(qū)序列。因此綜合以上結(jié)果，提示分離到的病毒為SASR冠狀病毒 為比較來源于SARS病人人體組織和已經(jīng)分離、培養(yǎng)的SARS-CoV基因組之間的差異，闡明病毒的遺傳和變異特點(diǎn)并深入

4、探討其致病機(jī)制，利用RT-PCR從北京地區(qū)一例SARS死亡病人(＃5)肺組織總RNA中對(duì)SARS-CoV組織毒的基因組全長(zhǎng)cDNA進(jìn)行了克隆和序列分析。參考已經(jīng)發(fā)表的SARS-CoV全序列，將待測(cè)定的SARS-CoV全長(zhǎng)基因組分成26個(gè)片段，設(shè)計(jì)引物進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增并克隆的26個(gè)目的片段覆蓋SARS-CoV全長(zhǎng)基因組。測(cè)序結(jié)果表明本次實(shí)驗(yàn)中SARS-CoV-5＃毒株基因組全長(zhǎng)29707個(gè)核苷酸。同源性比對(duì)結(jié)果表明，SARS-CoV組織毒5

5、＃基因組序列與BJ01-BJ04地方分離株為同一流行株型。本次試驗(yàn)測(cè)定的組織毒的基因組序列在基因組水平上與18株全序列已知人源毒株的堿基差異不明顯，而與10株動(dòng)物來源的SARS-CoV分離株全序列在92個(gè)核酸位點(diǎn)上存在明顯差異，這說明人源SARS-CoV毒株的全序列與動(dòng)物源SARS-CoV毒株的全序列存在基因組水平的破基差異，而細(xì)胞培養(yǎng)和人體組織來源的SARS毒株不存在基因組水平的堿基差異。對(duì)各種來源的SARS病毒的S蛋白質(zhì)基因分析同樣

6、也顯示了類似的堿基差異分布特點(diǎn)，即人源和動(dòng)物源的SARS-CoVS基因存在多處實(shí)質(zhì)性差異，而組織毒和培養(yǎng)毒株間的堿基差異不明顯、由此推斷SARS-CoV在病毒種屬進(jìn)化過程中，特別是在病毒宿主遷移過程中，發(fā)生多處實(shí)質(zhì)性點(diǎn)突變以適應(yīng)從動(dòng)物到人體環(huán)境的宿主環(huán)境差異。 為了進(jìn)一步研究SARS-CoV主要結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)在病毒復(fù)制中的功能，首先在昆蟲細(xì)胞中對(duì)它們進(jìn)行了表達(dá)，然后在昆蟲細(xì)胞中進(jìn)行SARS-CoV病毒樣顆粒(viral-likep

7、article，VLP)的體外裝配試驗(yàn)。為提高上述結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)基因在昆蟲細(xì)胞中的表達(dá)水平，提高VLP體外裝配的效率，首先通過拼接PCR方法人正合成并克隆了密碼子優(yōu)化的SASR-CoV結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)基因E和M的完整閱讀框Eop、Mop，測(cè)序結(jié)果表明合成基因符合預(yù)期設(shè)計(jì)。另外為便于檢測(cè)，在Mop基因蛋白質(zhì)編碼區(qū)緊鄰終止密碼子前插入FLAG肽標(biāo)簽編碼序列，獲得Mop(F)基因。隨后將經(jīng)過密碼子優(yōu)化的SASR-CoV主要結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)基因Sop、Eop、

8、Mop、Mop(F)及野生型Nwt基因，分別或依設(shè)計(jì)組合插入桿狀病毒轉(zhuǎn)座載體，通過細(xì)菌內(nèi)轉(zhuǎn)座實(shí)驗(yàn)獲得一組包含上述目的基因或基因組合的重組桿狀病毒Bacmid。將重組桿狀病毒Bacmid轉(zhuǎn)染Sf9昆蟲細(xì)胞后，獲得相應(yīng)的重組桿狀病毒。蛋白質(zhì)質(zhì)印跡法檢測(cè)表明，獲得的重組桿狀病毒在Sf9細(xì)胞中可高效表達(dá)SARS-CoV的4種結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)S、M、E、N，表達(dá)產(chǎn)物抗原性和分子量符合預(yù)期。 將各種重組桿狀病毒以不同的組合形式感染Sf9細(xì)胞，進(jìn)

9、行SARS-CoV病毒樣顆粒(VLP)的體外組裝試驗(yàn)。結(jié)果表明，M、E、S蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的同時(shí)表達(dá)，可在細(xì)胞漿內(nèi)組裝出形態(tài)學(xué)上與感染Vero細(xì)胞內(nèi)SARS-CoV顆粒相似的結(jié)構(gòu)；E、M蛋白質(zhì)在昆蟲細(xì)胞Sf9內(nèi)同時(shí)表達(dá)時(shí)也可在胞漿內(nèi)產(chǎn)生類似成熟病毒顆粒的結(jié)構(gòu)。據(jù)報(bào)道M蛋白質(zhì)C末端突變對(duì)該蛋白質(zhì)在病毒粒子組裝過程中具有破壞作用。本次實(shí)驗(yàn)中，M蛋白質(zhì)C末端插入FLAG肽標(biāo)簽后同樣可與共表達(dá)的E蛋白質(zhì)在昆蟲細(xì)胞胞漿內(nèi)形成VLP，這表明本實(shí)驗(yàn)中，