重組工程菌合成5-氨基酮戊酸的限制因子的初步研究.pdf

1、5-氨基酮戊酸(5-aminolevulinicacid，ALA)在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中具有廣泛的應(yīng)用，不僅可作為除草劑、殺蟲劑，還可提高植物的抗鹽、抗冷凍能力，這對于緩解生態(tài)環(huán)境惡化，提高農(nóng)業(yè)生產(chǎn)水平具有重要的現(xiàn)實意義。此外，5-氨基酮戊酸也被廣泛用于腫瘤的診斷及癌癥的治療方面。目前，ALA的工業(yè)化生產(chǎn)主要是利用光合細菌突變株和大腸桿菌的重組菌表達5-氨基酮戊酸合酶，該酶在細胞內(nèi)催化琥珀酰輔酶A和甘氨酸縮合成ALA。ALA的生物合成受終產(chǎn)物血紅

2、素的反饋抑制。本研究中，采用大腸桿菌重組技術(shù)，表達了有活性的釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)的5-氨基酮戊酸合酶，研究重組菌株合成ALA的能力，并測定胞內(nèi)和胞外ALA的產(chǎn)量。初步分析了影響細胞合成ALA的一些限制因子，摸索了ALA的快速純化方法。結(jié)果表明： 1.根據(jù)已公布的hem1基因的全序列，以釀酒酵母基因組為模板，去除N端導(dǎo)肽序列的核苷酸序列，以編碼Asn63為第一個氨基酸殘基，上游引物編碼的起始

3、氨基酸為Met，設(shè)計并合成引物，采用PCR擴增出一個大小約為1.4-1.5kb的特異DNA片段，采用載體pMAL-2x，構(gòu)建重組ALAS表達載體pMAL-ALAS，通過酶切驗證初步證明外源基因片段已正確插入載體pMAL-2x，進一步測序表明插入的外源片段同已公布的釀酒酵母hem1基因片段的序列完全相同。 2.重組載體和對照分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌表達菌株，生長24h的菌落在紫外光下顯示強烈紅色熒光，表明有下游的中間物的氧化形式卟啉的積

4、累。攜帶重組載體的菌株生長速度落后于對照菌株，可能是積累的卟啉會產(chǎn)生自由基，對細胞膜產(chǎn)生破壞作用，抑制了細胞的生長。誘導(dǎo)后的大腸桿菌重組菌顯示重組蛋白表達為可溶性，SDS-PAGE分析表明ALAS蛋白亞基分子量約為49kDa。誘導(dǎo)物IPTG濃度為0.10mmol/L時ALAS酶活達最大。 3.分析了影響ALA生物合成的一些限制因子。不同的pH值對重組菌ALA的合成影響很大，pH7.0時酶活最高，而在pH6.5時ALA的產(chǎn)量與菌

5、液濃度的比值最大。添加外源前底物琥珀酸對ALA產(chǎn)量產(chǎn)生影響且在20mmol/L時影響最大。添加20mmol/L的甘氨酸刺激細胞ALA的合成且產(chǎn)量最高，而濃度高于80mmol/L的甘氨酸會抑制菌體生長。 4.國產(chǎn)的大孔徑樹脂純化ALA結(jié)果表明大孔徑樹脂Ⅰ對ALA以外的雜物質(zhì)有吸附作用，大孔徑樹脂Ⅱ?qū)LA有專一性吸附作用，經(jīng)過二步層析后得到的ALA溶液，冷凍干燥，毛細管電泳分析確定ALA純度很高。 綜上所述，本文已成功