組織工程技術(shù)移植雪旺細胞治療脊髓損傷的初步實驗研究.pdf

1、隨著現(xiàn)代工業(yè)、交通運輸業(yè)和建筑業(yè)的發(fā)展，脊髓損傷(spinal cord injury，SCI)的發(fā)生率也呈逐年上升的趨勢。據(jù)報道，美國每年約有1萬例新的脊髓損傷患者，我國上海脊髓損傷的年發(fā)生率約為13.7/100萬。當(dāng)今脊髓損傷在全球呈：高致殘率(全癱為67％)、高耗費(5-7萬美元/患者/年，美國)、低死亡率(<5％)、患者主要為青壯年(70％患者<40歲)等特點，給社會帶來巨大的損失和沉重的負擔(dān)，已成為全球性的醫(yī)療難題。目前臨床上

2、對脊髓損傷的治療主要著手于防治脊髓損傷后脊髓繼發(fā)性損害、保護殘存神經(jīng)元功能，方法有早期大劑量甲基強的松龍沖擊療法、外科干預(yù)及康復(fù)訓(xùn)練等，而這些方法對軸突連續(xù)性中斷導(dǎo)致的神經(jīng)元靶源性營養(yǎng)供給減少和生理電信號及化學(xué)傳遞功能受損的作用微乎其微，因而預(yù)后仍然很差。這是由于脊髓損傷后脊髓神經(jīng)元再生功能差，損傷區(qū)域與正常組織之間有星形膠質(zhì)細胞增生形成膠質(zhì)瘢痕作為物理屏障及受損神經(jīng)元軸突缺少神經(jīng)營養(yǎng)因子的刺激而無延長能力作為化學(xué)屏障等因素有關(guān)。因此，

3、促進脊髓再生、克服再生屏障是目前國內(nèi)外研究的重點及熱點。本項目旨在探索利用組織工程技術(shù)進行自體雪旺氏細胞移植的方法治療脊髓損傷，使脊髓損傷后神經(jīng)纖維再生、傳導(dǎo)功能恢復(fù)，為脊髓損傷的治療作進一步基礎(chǔ)及臨床研究提供理論基礎(chǔ)。 近20年來國內(nèi)外研究已證明，成年神經(jīng)元具有再生的潛能，損傷的脊髓神經(jīng)元在適宜的條件下可以再生。在促進軸突再生的基礎(chǔ)研究中，通過多種技術(shù)如細胞移植、基因治療、細胞內(nèi)分子信號的修飾和克服再生屏障等研究，證實成年哺乳

4、動物的中樞神經(jīng)元在受損后確實可以再生，甚至產(chǎn)生靶支配。但脊髓損傷后解剖重建和功能恢復(fù)是十分棘手的問題，當(dāng)前對脊髓損傷后修復(fù)研究的主要途徑是從促進神經(jīng)元軸突的再生和組織移植替代兩個方面來探討脊髓修復(fù)及功能恢復(fù)的可行性。于是，雪旺細胞移植治療脊髓損傷成為目前國內(nèi)外研究的熱點。 現(xiàn)已證實雪旺氏細胞分泌的神經(jīng)生長因子和細胞外基質(zhì)，對神經(jīng)再生具有重要作用。過去十余年，神經(jīng)科學(xué)工作者對雪旺細胞移植治療脊髓損傷進行了初步的探索，并證實雪旺氏細

5、胞移植可以促進脊髓損傷近端神經(jīng)元軸突向遠端延伸、損傷神經(jīng)元髓鞘化。但關(guān)于雪旺氏細胞的活化、移植方式及移植介質(zhì)仍在探索之中。目前國內(nèi)外學(xué)者重點從以下幾個方面進行研究：對雪旺氏細胞進行基因修飾使之分泌大量神經(jīng)生長因子以誘導(dǎo)脊髓神經(jīng)元的再生；神經(jīng)生長因子基因修飾后的雪旺氏細胞與膠原母細胞按一定比例(5∶1)培養(yǎng)于膠原基質(zhì)中，再植入脊髓損傷處，誘導(dǎo)脊髓神經(jīng)元再生；將聚乳酸支架制成筒狀直接包繞雪旺氏細胞植入脊髓損傷處從而治療脊髓損傷。同時，學(xué)者們

6、對各種脊髓損傷模型也進行了探討，包括挫傷、不完全損傷、橫斷損傷等。各種實驗在解剖重建和電生理檢測方面都得到滿意的結(jié)果，但運動功能恢復(fù)卻未見報告。組織工程技術(shù)是一門新興的醫(yī)學(xué)技術(shù)，在各個領(lǐng)域已顯出巨大的應(yīng)用前景。早在1995年就有研究人員應(yīng)用組織工程技術(shù)移植雪旺細胞治療脊髓損傷了，在神經(jīng)纖維再生方面獲得了可喜的成績，但由于支架材料選擇上的欠缺，并未有突破性的研究成果。本研究擬在脊髓損傷的組織工程技術(shù)方面進行進一步的探索?，F(xiàn)已證實在脊髓橫斷

7、損傷處移植雪旺氏細胞后，在移植體與脊髓斷端接觸面之間并無明顯的炎癥反應(yīng)，且脊髓兩斷端之間有有髓神經(jīng)纖維生長。因此本研究的基本思路是：取外周神經(jīng)分離、純化雪旺氏細胞，進行人類NGF(Nerve Growth Factor)基因轉(zhuǎn)染，使能夠穩(wěn)定高效表達NGF，然后將其注入膠原制成的海棉狀可吸收生物支架上，一起植入脊髓離斷傷處，觀察脊髓神經(jīng)元再生及脊髓傳導(dǎo)功能恢復(fù)的情況。從而評價應(yīng)用組織工程技術(shù)進行雪旺細胞移植在脊髓橫斷性損傷中的治療作用，為

8、脊髓損傷后的治療作進一步基礎(chǔ)及臨床研究提供理論基礎(chǔ)。 在本研究的第一部分，我們應(yīng)用植塊法與消化法相結(jié)合的方法進行原代雪旺細胞的培養(yǎng)。以新生SD大鼠的雙側(cè)坐骨神經(jīng)為材，剝?nèi)ド窠?jīng)外膜，剪成1mm大小的碎塊，用0.25％的胰蛋白酶和0.03％膠原酶消化12分鐘，然后種植培養(yǎng)，培養(yǎng)基為含10％胎牛血清的DMEM，24小時后用阿糖胞苷去除成纖維細胞，共24小時，以后每2-3天更換培養(yǎng)液。結(jié)果顯示，在培養(yǎng)的2-6天細胞生長迅速，12天后細胞

9、生長達到高峰。經(jīng)S-100熒光染色鑒定雪旺細胞，結(jié)合Hoechst核染色后可算出原代細胞純度達95.1％，傳一代后細胞純度更達96.3％，10個新生鼠經(jīng)過原代培養(yǎng)12天后可以獲得大約3.0×10<'6>的雪旺細胞。同時發(fā)現(xiàn)本方法所培養(yǎng)的雪旺細胞在28天后才開始凋亡，完全能滿足組織工程應(yīng)用的要求。 本研究的第二部分中，由Genebank中查得hNGF-β片段的序列，合成引物后成功構(gòu)建了hNGF-β基因片段，與Genebank中相符

10、合。接著進行慢病毒載體Lenfivirus的包裝。以Qiagen公司的提取慢病毒包裝系統(tǒng)由pGC-E1載體，pHelper 1.0(gag/pol元件)載體，Helper 2.0(VSV6元件)載體三質(zhì)粒組成，其中pgC-E1載體含有CMV啟動子驅(qū)動的熒光蛋白 GFP?？捎糜诓《景b時轉(zhuǎn)染效率，以及感染宿主細胞的感染效率的檢測。將6FP蛋白替換為其他外源基因，或者一同插入外源基因，既可以表達目的基因，又有熒光蛋白檢測。Helper 1.

11、0質(zhì)粒中含有HIV病毒的gag基因，編碼病毒主要的結(jié)構(gòu)蛋白；pol基因，編碼病毒特異性的酶；rev基因，編碼調(diào)節(jié)gag和pol基因表達的調(diào)節(jié)因子。pHelper 2.0質(zhì)粒中含有單純皰疹病毒來源的VSVg基因，提供病毒包裝所需要的衣殼蛋白。以293T細胞為包裝細胞，在病毒攜帶的綠色熒光蛋白的幫助下，很方便的能夠觀察到重組慢病毒 Lentivirus-hNGFβ的產(chǎn)生。應(yīng)用本方法成功地獲得了高滴度的單一重組病毒(2×10<'8>TU/ml

12、)。 在第三部分的研究中，我們在前兩部分的基礎(chǔ)上在體外檢測了所構(gòu)建的重組慢病毒載體Lentivirus-hNGF β對雪旺細胞的感染效率。分別以MOI值為1、5、10、20、40對雪旺細胞進行感染，結(jié)果顯示當(dāng)MOI值為10時感染效率最高，可達90％。GFP在雪旺細胞內(nèi)的表達在感染7天達到高峰。經(jīng)RT-PCR證實有hNOF mRNA的表達，以山羊抗hNGF抗體行western Blot實驗亦證實了NGF的表達，從而為下一步的體內(nèi)實

13、驗提供了可靠的實驗數(shù)據(jù)。 在前面三部分研究的基礎(chǔ)上，我們進行了第四部分的體內(nèi)實驗。以雌性SD成鼠為動物模型，在T8-9平面離斷脊髓約3cm，以膠原海棉為生物支架植入脊髓離斷處，然后將基因修飾的雪旺細胞懸液注入支架上，每個老鼠的細胞植入量約為2×10<'6>。在移植后1周、1個月、2個月的3個時間段分別取材觀察細胞的存活情況、NGF的表達以及支架吸收情況。經(jīng)熒光顯微鏡觀察顯示，雪旺細胞在體內(nèi)的支架上2個月后仍存活良好，經(jīng)電鏡觀察亦

14、證實了雪旺細胞的存活。經(jīng)免疫組化及Western Blot實驗檢測到NGF得到了良好的表達，初步說明了該組織工程技術(shù)治療脊髓損傷的可行性。 通過以上實驗我們成功地在體外培養(yǎng)了原代雪旺細胞，并了解了雪旺細胞的生長規(guī)律；成功地構(gòu)建了慢病毒 Lentivirus-hNGF 基因載體并在體外檢測了Lentivirus-hNGF對雪旺細胞的轉(zhuǎn)染效率。將hNGF基因修飾的雪旺細胞與膠原海棉可吸收生物支架一起植入脊髓離斷傷處，雪旺細胞與膠原海