多孔鉭對人成骨細(xì)胞COL-Ⅰ、OC及OPN表達(dá)影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：研究多孔鉭支架材料對 MG63人成骨細(xì)胞增殖、分泌功能以及成骨基因COL-Ⅰ、OC、OPN及蛋白表達(dá)影響，探討多孔鉭支架材料作為骨組織工程支架材料來修復(fù)骨缺損，恢復(fù)骨組織正常生理結(jié)構(gòu)與功能的可行性，為進(jìn)一步臨床應(yīng)用提供理論與實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法：1掃描電鏡觀察多孔鉭支架材料形態(tài)特征。2 MG63人成骨細(xì)胞培養(yǎng)及鑒定。分組：以α-MEM完全培養(yǎng)基為浸提介質(zhì)制備鉭浸提液，A組為鉭浸提液組（鉭浸提液與成骨細(xì)胞共培養(yǎng)），B組為鉭支架

2、組（鉭支架材料與成骨細(xì)胞共培養(yǎng)），C組為空白組（單純成骨細(xì)胞培養(yǎng)）。3 CCK-8法分別檢測各組成骨細(xì)胞的生長增殖狀態(tài)。4倒置相差顯微鏡、掃描電鏡、透射電鏡觀察成骨細(xì)胞在多孔鉭支架上黏附、增殖及超微結(jié)構(gòu)變化。5 ELISA法分別檢測多孔鉭對成骨細(xì)胞分泌COL-Ⅰ與 OC功能的影響。6免疫細(xì)胞化學(xué)染色法檢測成骨細(xì)胞 COL-Ⅰ、OC、OPN的蛋白表達(dá)并通過圖像半定量分析測定光密度（IOD）值。7 Western-blot法檢測多孔鉭支架對

3、成骨細(xì)胞 COL-Ⅰ、OC、OPN蛋白表達(dá)的影響。8實(shí)時熒光定量PCR法檢測多孔鉭支架對成骨細(xì)胞COL-Ⅰ、OC、OPN mRNA表達(dá)的影響。
　　結(jié)果：1多孔鉭支架材料外觀為灰色，光潔，表面粗糙，凹凸不平，質(zhì)硬，材料表面及斷面可見均勻分布的蜂窩狀、針尖大小的孔隙。掃描電鏡下觀察，多孔鉭具有大量分散微孔結(jié)構(gòu)，孔隙間相互連通，類似人松質(zhì)骨結(jié)構(gòu)。2 CCK-8結(jié)果顯示，隨著培養(yǎng)時間延長，3組細(xì)胞能夠良好的貼壁及生長增殖，數(shù)量由緩慢到快

4、速增殖，而后穩(wěn)定生長。經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析得出，3組間細(xì)胞增殖比較均無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。3倒置相差顯微鏡觀察：多孔鉭邊緣及四周黏附大量成骨細(xì)胞，細(xì)胞形態(tài)正常，呈現(xiàn)多角形及長梭形。掃描電鏡顯示，隨著多孔鉭與成骨細(xì)胞復(fù)合培養(yǎng)時間的延長，成骨細(xì)胞數(shù)量隨之增多，向材料孔隙生長，細(xì)胞伸出偽足，分泌的基質(zhì)逐漸覆蓋材料表面及孔隙。透射電鏡顯示，A組與 B組成骨細(xì)胞胞漿內(nèi)具有豐富的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體及高爾基體等細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)。4成骨細(xì)胞 COL-Ⅰ及

5、OC分泌功能的檢測：第3d時，A、B及C組之間比較OC分泌差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；第5d與7d時，B組OC分泌量高于A、C組（P＜0.05）。而在不同時間點(diǎn)3組間COL-Ⅰ分泌量均無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。5免疫細(xì)胞化學(xué)染色顯示：第5d時，3組細(xì)胞均有 COL-Ⅰ、OC、OPN的表達(dá)，胞漿內(nèi)出現(xiàn)大量棕黃色顆粒，其中B組OC與OPN表達(dá)的IOD值高于A、C組（P＜0.05），而COL-Ⅰ表達(dá)的IOD值在3組中差異無統(tǒng)計學(xué)意

6、義（P＞0.05）。6 Western-blot結(jié)果顯示：第5d時，3組細(xì)胞均有COL-Ⅰ、OC、OPN蛋白的表達(dá)，B組OC與OPN表達(dá)高于A、C組（P＜0.05），而3組間COL-Ⅰ蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。7實(shí)時熒光定量PCR結(jié)果顯示：第5d時，A、B組OC、OPN mRNA的表達(dá)均高于C組，B組的表達(dá)高于A組（P＜0.05），而3組間COL-ⅠmRNA表達(dá)差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。
　　結(jié)論：1多孔

7、鉭支架（三維結(jié)構(gòu)）與多孔鉭浸提液（二維結(jié)構(gòu)）均有利于人成骨細(xì)胞早期生長、黏附及增殖作用。提示：多孔鉭具有良好的細(xì)胞親和力和生物相容性。2多孔鉭三維空間構(gòu)型可促使人成骨細(xì)胞在材料表面黏附并分泌 OC，維持骨形成及骨吸收之間平衡并有利于骨礦化過程；而成骨細(xì)胞 COL-Ⅰ分泌則不受多孔鉭空間構(gòu)型影響，始終貫穿于成骨全過程，以成骨早期最為顯著。3 Western-blot及實(shí)時熒光定量 PCR檢測結(jié)果提示：人成骨細(xì)胞在多孔鉭三維結(jié)構(gòu)培養(yǎng)條件下，