SRPK1在TGF-β介導(dǎo)的食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞的增殖和凋亡中的作用.pdf

1、到目前為止，TGF-β-SRPK1在ESCC中的確切作用仍不清楚。為探究SRPK1在TGF-β介導(dǎo)的食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞生物學(xué)過程中的作用和意義，我們應(yīng)用免疫組化法、免疫印跡法及RT-PCR法檢測120例食管鱗狀細(xì)胞癌樣本及細(xì)胞系中SRPK1的表達(dá)水平。并在體外實(shí)驗(yàn)中，檢測加入TGF-β作用后的食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞中的SRPK1的表達(dá)水平，從而分析并總結(jié)SRPK1在ESCC組織和細(xì)胞中的表達(dá)譜及其生物學(xué)作用，著重于探究發(fā)展有效的抗-SRPK

2、1治療方法的臨床價(jià)值和優(yōu)勢。
　　第一部分 SRPK1在食管鱗癌中的表達(dá)及臨床意義
　　目的：
　　本研究通過應(yīng)用免疫組織化學(xué)以及基因和蛋白檢測方法觀察SRPK1在食管癌組織及正常食管組織中的表達(dá)，并分析其在食管癌發(fā)生和發(fā)展及腫瘤轉(zhuǎn)移、病理分級(jí)、臨床分期中的關(guān)系，探討SRPK1可能作為致癌基因在食管癌的診斷和治療的臨床價(jià)值，為其治療提供新的靶點(diǎn)。
　　方法：
　　本實(shí)驗(yàn)選取山東省腫瘤醫(yī)院及山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院附

3、屬醫(yī)院胸外科自2008年10月至2010年6月收治的120例食管癌病人，病人均經(jīng)過手術(shù)治療，切除的食管癌標(biāo)本經(jīng)兩名病理科醫(yī)師獨(dú)立診斷證實(shí)。標(biāo)本中癌組織作為實(shí)驗(yàn)組，相應(yīng)標(biāo)本的上切緣組織即距腫瘤5cm以上的正常食管組織作為實(shí)驗(yàn)對(duì)照組進(jìn)行配對(duì)分組研究。應(yīng)用免疫組織化學(xué)法檢測SRPK1蛋白在食管癌組織及與其配對(duì)正常組織中表達(dá)的差異，探討其在腫瘤演生、進(jìn)展過程中的作用。采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，SRPK1與食管癌臨床病

4、理因素之間的分析采用行卡方檢驗(yàn)。以a=0.05作為統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)水準(zhǔn)。
　　結(jié)果:
　　1.SRPK1在ESCC組織中的表達(dá)
　　免疫組化染色表明，在120例ESCC組織中，有65例顯示了高SRPK1表達(dá)，而在這65例ESCC組織中，SRPK1蛋白主要在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中表達(dá)，其中包括29例(++)和31例(+++)。然而，在癌周正常組織中則很少出現(xiàn)SRPK1染色。此外，SRPK1 mRNA的表達(dá)水平在腫瘤組織中明顯增高。與

5、無癌轉(zhuǎn)移的食管組織相比，在有癌轉(zhuǎn)移的ESCC樣本中SRPK1 mRNA及蛋白的表達(dá)水平均顯著升高。
　　2.SRPK1與腫瘤臨床病理特點(diǎn)之間的關(guān)系
　　SRPK1的表達(dá)與腫瘤臨床分期及腫瘤大小無明顯相關(guān)性。相反，SRPK1的表達(dá)量與ESCC的轉(zhuǎn)移之間具有顯著相關(guān)性，其差異具有的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.001)。
　　3.SRPK1表達(dá)水平與ESCC病人預(yù)后的關(guān)系 Kaplan-Meier生存曲線顯示SRPK1表達(dá)水平與總生

6、存率偏低密切相關(guān)(p＜0.000)。另外，單因素分析結(jié)果證實(shí)，SRPK1高表達(dá)的病人發(fā)生死亡的風(fēng)險(xiǎn)顯著升高(p＜0.001)。同時(shí)，單因素分析結(jié)果還顯示，ESCC轉(zhuǎn)移性與不良預(yù)后有關(guān)，然而，患者的年齡、性別和腫瘤侵襲深度與預(yù)后之間無關(guān)聯(lián)。多因素分析結(jié)果也顯示，SRPK1表達(dá)可作為預(yù)測ESCC病人預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測因子(p＜0.001)。
　　結(jié)論:
　　SRPK1蛋白在食管癌組織中的陽性表達(dá)率高于正常食管組織。SRPK1蛋白的陽

7、性表達(dá)與臨床分期及腫瘤大小無明顯相關(guān)性，與ESCC的轉(zhuǎn)移之間具有顯著相關(guān)性。SRPK1表達(dá)水平與總生存率偏低密切相關(guān)，且高表達(dá)的ESCC患者的死亡風(fēng)險(xiǎn)明顯增高，因此，SRPK1的表達(dá)可作為預(yù)測ESCC患者預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測因子。
　　第二部分 SRPK1在TGF-β介導(dǎo)的食管鱗癌細(xì)胞的增殖和凋亡中的作用
　　目的:
　　1.研究SRPK1在TGF-β介導(dǎo)的食管鱗狀細(xì)胞癌組織及細(xì)胞系的表達(dá)水平。
　　2.研究SRPK1

8、在TGF-β介導(dǎo)的食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞的增殖和凋亡過程中的作用和意義。
　　3.探究SRPK1在TGF-β介導(dǎo)的食管鱗狀細(xì)胞癌組織及細(xì)胞中的生物學(xué)作用。
　　方法:
　　1.SRPK1-WT及SRPK1-KD質(zhì)粒和腺病毒載體的構(gòu)建
　　建立人ESCC細(xì)胞系EC109、TE8和TE2細(xì)胞，以進(jìn)行相關(guān)的SRPK1的細(xì)胞水平檢測。野生型SRPK1(SRPK1-WT)的全長cDNA通過RT-PCR擴(kuò)增正常食管上皮細(xì)胞mRN

9、A獲得，而SRPK1(SRPK1-KD)無活性激酶突變體則通過將第109位的賴氨酸催化突變?yōu)楸彼岖@得。隨后，將SRPK1-WT或者SRPK1-KD的cDNA插入pcDNA3.1(-)A-myc/his表達(dá)載體。通過AdEasyTM XL腺病毒載體系統(tǒng)構(gòu)建腺病毒表達(dá)SRPK-WT或SRPK1-KD。
　　2.抗SRPK1質(zhì)粒及siRNA轉(zhuǎn)染
　　質(zhì)粒和siRNA均以脂質(zhì)體2000為載體轉(zhuǎn)入細(xì)胞內(nèi)，Western blot法檢

10、測轉(zhuǎn)染效率。應(yīng)用Western blot及RT-PCR方法分別檢測EC109、TE8和TE2細(xì)胞系中SRPK1的表達(dá)，同時(shí)還應(yīng)用Western blot法檢測細(xì)胞中AKT和JNK的磷酸化水平，從而評(píng)估SRPK1對(duì)TGF-β信號(hào)通路的潛在作用。
　　3.細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)檢測檢測SRPK1野生型及激酶失活型細(xì)胞的生存率，以探究SRPK1對(duì)細(xì)胞增殖的影響。
　　4.采用TUNEL實(shí)驗(yàn)和免疫印跡方法探究SRPK1對(duì)ESCC細(xì)胞凋亡的影響

11、。并設(shè)計(jì)損傷愈合實(shí)驗(yàn)和侵襲實(shí)驗(yàn)以探究SRPK1在EC109細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲過程的作用。
　　5.應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)和Western blot法選擇EC109細(xì)胞系來研究SRPK1對(duì)細(xì)胞周期的調(diào)控作用及對(duì)調(diào)控因子的表達(dá)的影響。
　　結(jié)果:
　　1.SRPK1在ESCC細(xì)胞中的表達(dá)
　　在不同的細(xì)胞系中SRPK1的表達(dá)水平有所不同。SRPK1在TE2細(xì)胞系中表達(dá)水平最高，在EC109細(xì)胞系中表達(dá)水平最低。在EC109、T

12、E8和TE2細(xì)胞系中，SRPK1主要在細(xì)胞膜或者細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)。
　　2.SRPK1影響細(xì)胞增殖
　　野生型SRPK1可增強(qiáng)三種ESCC細(xì)胞系細(xì)胞的增殖作用，而激酶失活型則可抑制細(xì)胞增殖。同時(shí)，SRPK1基因沉默可顯著抑制腫瘤細(xì)胞增殖。
　　3.SRPK1影響細(xì)胞凋亡
　　SRPK1基因敲除的陽性細(xì)胞中，活化-caspase3和cyclin D1的表達(dá)水平升高，而在對(duì)照siRNA組則無增高(p＜0.01)。同時(shí)，經(jīng)

13、si-SRPK1治療后，EC109細(xì)胞可出現(xiàn)凋亡相關(guān)的形態(tài)變化，如細(xì)胞萎縮變圓、細(xì)胞膜空泡化、細(xì)胞核斷裂凝結(jié)等。在TE8和TE2等其他ESCC細(xì)胞系中，si-SRPK1作用后的細(xì)胞也會(huì)出現(xiàn)相同的變化。
　　4.SRPK1調(diào)節(jié)AKT和JNK信號(hào)
　　與對(duì)照siRNA組相比，在si-SRPK1處理組，磷酸化-AKT在三種ESCC細(xì)胞系中的表達(dá)水平均顯著降低(p＜0.01)，而磷酸化-JNK的表達(dá)水平則明顯增高(p＜0.01)。<

14、br>　　5.SRPK1調(diào)控ESCC細(xì)胞的細(xì)胞周期、轉(zhuǎn)移和侵襲過程
　　EC109細(xì)胞周期G1期向S期轉(zhuǎn)化的過程受到SRPK1 siRNA的抑制。同時(shí)，與對(duì)照組相比，ESCC細(xì)胞中的cyclin D1和CDK2的表達(dá)水平也受到明顯抑制。損傷愈合實(shí)驗(yàn)顯示，SRPK1 siRNA轉(zhuǎn)染后的EC109細(xì)胞的遷移性下降明顯。同樣，在侵襲實(shí)驗(yàn)中，與未轉(zhuǎn)染組相比，SRPK1 siRNA轉(zhuǎn)染后的EC109細(xì)胞的侵襲性也受到明顯的抑制(p＜0.00