人參皂苷Rg3抗肺癌機(jī)制及增加吉非替尼藥物敏感性的研究.pdf

1、一、目的與意義：
　　肺癌是世界范圍內(nèi)最常見的惡性腫瘤，在惡性腫瘤死亡率中居第一位。主要分為小細(xì)胞肺癌和非小細(xì)胞肺癌兩大類型，其中非小細(xì)胞肺癌是最常見的類型，約占85％。雖然在過去的幾十年放化療取得巨大的進(jìn)步，由于毒副作用的產(chǎn)生限制了它們的應(yīng)用。近幾年，靶向藥物如吉非替尼不斷問世，肺癌的治療取得一定的成績(jī)，然而，多數(shù)患者在治療一年內(nèi)產(chǎn)生耐藥，使得肺癌患者的前景依然暗淡。對(duì)于肺癌的治療依然需要尋求機(jī)制明確的新靶點(diǎn)、新藥物及新的治療策

2、略。
　　腫瘤糖生物學(xué)研究表明特定的糖基合成與腫瘤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，研究證實(shí)巖藻糖基化在腫瘤增殖與轉(zhuǎn)移中起著關(guān)鍵作用。在胰腺癌中，降低巖藻糖sLe a和sLe x的表達(dá)抑制了E-selectin介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的粘附以及細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)的轉(zhuǎn)移能力。異常的巖藻糖基化是由特定的巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶（fucosyltransferases，F(xiàn)UTs）催化合成。FUT4是巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶其中之一，定位于高爾基體上，能夠催化GDP-Fuc的Fuc

3、轉(zhuǎn)移至糖鏈中N-乙酰氨基葡萄糖上，是合成糖抗原LeY的關(guān)鍵酶。FUT4在多種腫瘤中高表達(dá)，如胃癌、胰腺癌、結(jié)腸癌和卵巢癌等。FUT4的表達(dá)水平與腫瘤的增殖、凋亡、轉(zhuǎn)移及EMT密切相關(guān)。下調(diào)FUT4能夠抑制乳腺癌的增殖，促進(jìn)惡性黑色素瘤A431細(xì)胞凋亡，抑制乳腺癌EMT。但FUT4是否與肺癌的EMT有關(guān)還不清楚。
　　吉非替尼是EGFR-TKIs藥物其中之一，已經(jīng)被很好的確立為肺癌患者的治療選擇。吉非替尼連接在 EGFR上抑制它的下

4、游通路，這些通路涉及腫瘤增殖、遷移、侵襲以及血管生成的激活。雖然NSCLC患者在剛開始對(duì)吉非替尼敏感，但是大多數(shù)在一年內(nèi)發(fā)生了耐藥，形成了這些有效治療途徑的最大限制。目前，接受吉非替尼治療的肺癌患者病情發(fā)生進(jìn)展，還沒有更好的治療選擇。引起肺癌患者對(duì)吉非替尼發(fā)生耐藥的機(jī)制有EGFR的二次突變（19號(hào)外顯子上的D761Y，20號(hào)外顯子上的T790），MET的擴(kuò)增，持續(xù)性survivin過表達(dá)，JAK2/STAT3的組成性激活和PI3K/Ak

5、t通路的激活。據(jù)顯示STAT3在很多腫瘤治療中，已經(jīng)被證實(shí)是一個(gè)比較有吸引力的治療靶點(diǎn)，它的持續(xù)性激活可以被JAK家族、EGFR和SRC誘導(dǎo)。STAT3的激活在腫瘤進(jìn)展中通過促進(jìn)細(xì)胞增殖、細(xì)胞生存、血管生成和腫瘤免疫逃避發(fā)揮重要作用，同時(shí)它與腫瘤患者預(yù)后差相關(guān)。因此，有效抑制STAT3的激活是提高吉非替尼藥物敏感性的一個(gè)關(guān)鍵性需要。
　　人參皂苷是從傳統(tǒng)中藥人參中提取的活性單體藥物成分，具有廣泛的藥理學(xué)活性和治療作用。目前，有40

6、多種人參皂苷化合物被認(rèn)定，其中，Rg3受到越來越多的關(guān)注。Rg3應(yīng)用于多種腫瘤的抗腫瘤治療，包括乳腺癌、胃癌、結(jié)直腸癌、肝癌、卵巢癌等。報(bào)道顯示 Rg3在肺癌治療中也取得了令人矚目的效果。目前，臨床上常用的藥物參一膠囊，其主要成分為 Rg3，已經(jīng)在中國被批準(zhǔn)為治療晚期非小細(xì)胞肺癌的輔助藥物。Rg3能夠抑制肺癌增殖，促進(jìn)凋亡，抑制血管生成和轉(zhuǎn)移。此外，Rg3能夠增加多種化療藥物及靶向藥物的藥物敏感性。然而，Rg3是否能夠通過FUT4發(fā)揮抗

7、肺癌效果；是否能夠提高吉非替尼抗肺癌的療效還不清楚。本研究旨在探討人參皂苷 Rg3的抗肺癌機(jī)制以及是否能夠增加吉非替尼抗肺癌的藥物敏感性。
　　二、實(shí)驗(yàn)方法：
　　1、收集大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院存檔的石蠟組織標(biāo)本且臨床資料完整的非小細(xì)胞肺癌患者56例，正常石蠟組織標(biāo)本35例，新鮮肺癌組織及正常肺組織10例。采用免疫組化及Western blot方法測(cè)定所有病理標(biāo)本中及新鮮組織中FUT4的表達(dá)情況。分析FUT4與患者臨床病理

8、特征的相關(guān)性。應(yīng)用 SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，以P＜0.05為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；
　　2、采用脂質(zhì)體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染技術(shù)將 FUT4的shRNA轉(zhuǎn)染至人肺癌細(xì)胞中，下調(diào)FUT4的表達(dá)；
　　3、采用ELISA方法檢測(cè)p-JAK2/JAK2的表達(dá)；
　　4、采用 Real-time PCR方法檢測(cè)FUT4、Snail、E-cadherin、N-cadherin和Vimentin基因的表達(dá)；
　　5、采用Weste

9、rn blot方法檢測(cè)FUT4、Snail、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、UEA、LeY、PARP1/2、Caspase3、Caspase8、Caspase9、EGFR/MAPK、NF-κB和JAK2/STAT3信號(hào)通路等相關(guān)蛋白的表達(dá)；
　　6、采用免疫熒光方法檢測(cè)FUT4、Snail、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin和LeY基因的表達(dá)；
　　7、采用免疫組化方法

10、檢測(cè)FUT4、N-cadherin、E-cadherin、P-EGFR、P-JAK2和Caspase3的表達(dá)；
　　8、采用CCK-8方法檢測(cè)細(xì)胞活性；
　　9、采用細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)分析細(xì)胞增殖能力；
　　10、采用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡。
　　三、結(jié)果：
　　(一) FUT4在肺癌中表達(dá)及其與EMT相關(guān)性的研究
　　1、FUT4在肺癌組織中比正常組織中表達(dá)高；
　　2、FUT4高表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)

11、移及腫瘤分期有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；
　　3、FUT4表達(dá)高低與N-cadherin的表達(dá)一致。
　　(二)人參皂苷Rg3通過下調(diào)FUT4抑制非小細(xì)胞肺癌的EMT及侵襲的研究
　　1、Rg3能夠有效抑制肺癌的遷移、侵襲；
　　2、Rg3抑制肺癌的EMT呈時(shí)間、劑量依賴性；
　　3、Rg3降低FUT4的表達(dá)呈時(shí)間、劑量依賴性；
　　4、下調(diào)FUT4的表達(dá)明顯抑制A549細(xì)胞的EMT；
　　5、下調(diào)FUT4的

12、表達(dá)降低LeY的合成，抑制EGFR的激活進(jìn)而阻斷其下游MAPK和NF-kB通路的激活；
　　6、Rg3在體內(nèi)抑制裸鼠腫瘤的生長和EMT及腫瘤結(jié)節(jié)在肺內(nèi)轉(zhuǎn)移。
　　(三)人參皂苷Rg3通過抑制JAK2/STAT3通路增加吉非替尼治療肺癌敏感性的研究
　　1、Rg3抑制人肺癌細(xì)胞A549、H1299、H358和H1975的增殖；
　　2、Rg3明顯抑制JAK2/STAT3信號(hào)通路；
　　3、吉非替尼引起JAK2

13、/STAT3信號(hào)通路激活；
　　4、JAK2抑制劑TG101348能夠提高吉非替尼抑制肺癌的增殖的療效；
　　5、Rg3通過抑制JAK2/STAT3通路提高吉非替尼抑制增殖、誘導(dǎo)凋亡的抗肺癌效應(yīng)；
　　6、Rg3在體內(nèi)增強(qiáng)吉非替尼抑制肺癌移植瘤生長的抗腫瘤效應(yīng)。
　　四、結(jié)論：
　　(一) FUT4在肺癌中表達(dá)及其與EMT相關(guān)性的研究
　　1、FUT4在肺癌中高表達(dá)；
　　2、FUT4高表達(dá)與淋

14、巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤分期有關(guān)；
　　3、FUT4表達(dá)與EMT呈正相關(guān)。
　　(二)人參皂苷Rg3通過下調(diào)FUT4抑制非小細(xì)胞肺癌的EMT及侵襲的研究
　　1、FUT4是Rg3的一個(gè)作用靶點(diǎn)；
　　2、Rg3抑制肺癌的遷移、侵襲和EMT與下調(diào)FUT4/LeY有關(guān)；
　　3、Rg3抑制肺癌EMT通過下調(diào)FUT4/LeY表達(dá)，抑制EGFR的激活及阻斷其下游的MAPK和NF-κB信號(hào)通路。
　　(三)人參皂苷 Rg