基于生物調(diào)控的Au納米顆粒合成及其細(xì)胞生物學(xué)效應(yīng)研究.pdf

1、納米材料具有獨(dú)特的物理和化學(xué)性質(zhì)，如大的比表面積、高的催化活性和生物相容性，已被廣泛地用于催化、能源、生物和分析等領(lǐng)域。隨著傳統(tǒng)的物理和化學(xué)制備納米材料方法的發(fā)展，近年來(lái)采用生物方法制備和組裝納米結(jié)構(gòu)材料的研究引起了廣泛的關(guān)注。生物合成的納米材料因富集大量生物活性分子被賦予獨(dú)特的物理化學(xué)特性、生物活性以及良好的分散性和穩(wěn)定性，使其在生物化學(xué)等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景。目前，已有多種生物包括細(xì)菌、放線(xiàn)菌、真菌以及一些高等植物用于合成金、銀、

2、硫化鎘、硫化鋅以及磁性氧化鐵等納米材料。與此同時(shí)，實(shí)現(xiàn)納米材料尺寸、形貌生物可控合成也成為納米生物合成新技術(shù)前沿研究領(lǐng)域之一。在本研究小組已有的納米生物技術(shù)研究工作基礎(chǔ)上，本論文瞄準(zhǔn)這一前沿研究方向，開(kāi)展了納米材料生物可控合成技術(shù)的研究。以4株真菌包括青霉(Penicillium sp.)、出芽短梗霉(Aureobasidium pullulan)、鐮刀菌(Fusarium sp.)及尖孢鐮刀霉(Fusarium oxysporum)和

3、尖葉擬船蘚植物(Dolichomitriopsisdiversiformis)為生物材料，研究了不同真菌合成Au納米顆粒的生化合成機(jī)制；發(fā)展了細(xì)胞內(nèi)調(diào)控合成不同尺寸Au納米顆粒新方法；探索了D.diversiformis植物細(xì)胞外調(diào)控合成不同形貌Au納米材料的規(guī)律；并進(jìn)一步考察了富集不同生物活性分子Au納米顆粒的細(xì)胞生物學(xué)效應(yīng)，以及對(duì)腫瘤細(xì)胞毒性作用機(jī)制。以期為生物調(diào)控合成納米材料基礎(chǔ)性研究和進(jìn)一步應(yīng)用提供有益的探索。本論文研究工作具體

4、包括以下幾方面：
　　1.不同真菌合成Au納米顆粒生化合成機(jī)制研究
　　利用環(huán)境分離的A.pullulans、Fusarium sp.及F.oxysporum3株真菌發(fā)展了真菌細(xì)胞內(nèi)合成Au納米材料的生物方法，并對(duì)其合成的生化合成機(jī)制進(jìn)行了比較分析。將A.pullulans、Fusarium sp.和F.oxysporum細(xì)胞與氯金酸共孵育，3株真菌均可細(xì)胞內(nèi)合成Au納米顆粒；生化成分分析及FTIR光譜表征發(fā)現(xiàn)，A。pull

5、ulans細(xì)胞以還原糖為生物活性分子介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)Au納米顆粒合成，而Fusariumsp.及F.oxysporum以蛋白質(zhì)為生物活性分子介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)Au納米顆粒組裝：進(jìn)一步SDS-PAGE蛋白質(zhì)電泳分析表明，F(xiàn)usarium sp.細(xì)胞內(nèi)分子量為100 kDa，25 kDa和19 kDa的蛋白質(zhì)參與Au納米顆粒合成，而F.oxysporum細(xì)胞內(nèi)分子量為25kDa和19 kDa蛋白質(zhì)參與Au納米顆粒合成，A.pullulans合成的Au納米

6、顆粒不存在蛋白質(zhì)。研究結(jié)果將揭示3株真菌細(xì)胞不同的生物活性分子介導(dǎo)了Au納米材料的合成。通過(guò)采用LC-MS/MS法對(duì)蛋白質(zhì)分子進(jìn)行鑒定，結(jié)果表明Fusariumsp.參與合成的Au納米顆粒的3個(gè)蛋白質(zhì)分別為脂膜ATP酶(plasma membraneATPase)、3-葡聚糖結(jié)合蛋白(3-glucan binding protein)及3-磷酸甘油脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)

7、，這些蛋白均為細(xì)胞能量代謝相關(guān)蛋白。細(xì)胞超薄切片表征發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞內(nèi)合成的Au納米顆粒均存在真菌細(xì)胞液泡中。時(shí)間動(dòng)力學(xué)TEM結(jié)果表明，還原糖易于合成球形、單分散性Au納米顆粒，蛋白質(zhì)易于介導(dǎo)Au納米顆粒聚合體的組裝。
　　2.基于溫度調(diào)控真菌細(xì)胞內(nèi)合成不同尺寸Au納米顆粒研究
　　以溫度為調(diào)控因子，利用環(huán)境分離的真菌Penicillium sp.發(fā)展了一種細(xì)胞內(nèi)調(diào)控合成尺寸可控的Au納米顆粒新方法。將真菌Penicillium

8、sp.細(xì)胞與氯金酸共培育后，可在細(xì)胞內(nèi)合成球形的、單分散性的Au納米顆粒，粒徑分布18-35 nm。合成動(dòng)力學(xué)TEM表征發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞吸收反應(yīng)溶液AuCl4-，在細(xì)胞內(nèi)首先被還原形成Au核，再組裝成Au納米顆粒。生物組分分析結(jié)果表明，Penicillium sp.細(xì)胞內(nèi)還原糖為活性組分介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)Au納米顆粒的合成。通過(guò)控制合成反應(yīng)溫度，在4℃條件下，Penicillium sp.細(xì)胞可細(xì)胞內(nèi)合成4-10 nm粒徑的Au納米顆粒。在28℃則合

9、成20-37 nm粒徑顆粒，在不恒定的溫度條件下，Penicillium sp.細(xì)胞則合成多分散性的Au納米顆粒。TEM結(jié)果表明，純化的Au納米顆粒也表現(xiàn)為球形、單分散性等相似的特征。FTIR光譜表征表明，純化的Au納米顆粒存在1405cm-1多糖羰基伸縮振動(dòng)。研究結(jié)果揭示通過(guò)控制反應(yīng)溫度條件，可實(shí)現(xiàn)真菌細(xì)胞內(nèi)對(duì)納米顆粒的尺寸控制。
　　3.基于pH調(diào)控植物細(xì)胞外合成不同形貌Au納米顆粒研究
　　利用尖葉擬船蘚(D.dive

10、rsiformis)植物體為生物材料，以pH為調(diào)控因子，發(fā)展了一種細(xì)胞外生物調(diào)控合成Au納米顆粒的新方法。將氯金酸鈉與過(guò)夜浸泡于不同pH溶液的蘚植物體混合液共孵育后，在pH3-6條件下，蘚植物體可合成球形、三角形、立方體等形貌的Au納米顆粒。生物組分分析發(fā)現(xiàn)，蘚植物蛋白質(zhì)為活性分子介導(dǎo)Au納米顆粒合成。PAGE分析表明，該蛋白質(zhì)分子量為71 kDa、等電點(diǎn)pI4.9。圓二色譜(Circular Dichroism，CD)表征發(fā)現(xiàn)，在不同

11、的pH溶液中該蛋白質(zhì)的二級(jí)構(gòu)象可以被誘導(dǎo)而改變。在pH3溶液中其二級(jí)結(jié)構(gòu)為無(wú)規(guī)則卷曲；pH4溶液中其二級(jí)結(jié)構(gòu)為中間過(guò)渡類(lèi)型；pH5溶液中其二級(jí)結(jié)構(gòu)為α螺旋；而在pH6條件下其二級(jí)結(jié)構(gòu)為無(wú)規(guī)則卷曲，并伴隨三級(jí)的改變。進(jìn)一步的重組裝實(shí)驗(yàn)結(jié)果揭示，該蘚植物蛋白在Au納米顆粒合成過(guò)程起著模板作用，并控制不同形貌Au納米顆粒的組裝。在pH3溶液中具有無(wú)規(guī)則卷曲二級(jí)結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)，可組裝三角形和球形兩種形貌Au納米顆粒，多分散性特征。pH4溶液中具有

12、中間過(guò)渡類(lèi)型二級(jí)結(jié)構(gòu)的蘚蛋白質(zhì)，可組裝球形Au納米顆粒，單分散性好。pH5溶液中具有α螺旋二級(jí)結(jié)構(gòu)的蘚蛋白質(zhì)，可組裝立方體形形貌的Au納米顆粒。在pH6條件下具有無(wú)規(guī)則卷曲二級(jí)結(jié)構(gòu)，并伴隨三級(jí)改變的蛋白質(zhì)，組裝的Au納米顆粒為多分散性的球形。研究結(jié)果揭示通過(guò)控制合成pH條件，可實(shí)現(xiàn)以蛋白質(zhì)為活性分子的生物調(diào)控合成不同形貌納米顆粒。
　　4.不同真菌合成的Au納米顆粒細(xì)胞生物學(xué)效應(yīng)研究
　　利用Penicillium sp.、

13、Fusarium sp.和F.oxysporum真菌調(diào)控合成了不同生物分子組成的球形Au納米顆粒，研究了3種Au納米顆粒引起的肝癌細(xì)胞株BEL7404細(xì)胞生物學(xué)形態(tài)變化，細(xì)胞粘附性改變，以及對(duì)細(xì)胞活性影響等一系列細(xì)胞生物學(xué)效應(yīng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果揭示，不同生物分子組成納米顆粒引起的細(xì)胞生物學(xué)效應(yīng)差異很大。Penicillium sp.細(xì)胞合成具有還原糖組成的Au納米顆粒對(duì)供試細(xì)胞BEL7404有較強(qiáng)的毒性，IC50為51μg。而Fusarium

14、sp.和F.oxysporum細(xì)胞合成的具有蛋白質(zhì)組成的Au納米顆粒對(duì)供試細(xì)胞BEL7404無(wú)毒性，具有較好的生物相容性?？梢?jiàn)，利用生物合成不同生化組成的Au納米顆粒有望發(fā)展為納米載體或者潛在納米藥物應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域。
　　5.基于蘚植物合成的蛋白質(zhì)Au納米顆粒細(xì)胞毒性機(jī)制研究
　　利用植物尖葉擬船蘚(D.diversiformis)合成了具有蛋白質(zhì)組成的球形Au納米顆粒，研究了蛋白質(zhì)Au納米顆粒與肝癌細(xì)胞株BEL740

15、4及肝正常細(xì)胞株L-02孵育后引起的細(xì)胞生物學(xué)效應(yīng)和細(xì)胞毒性及機(jī)制。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，蘚合成具有蛋白質(zhì)組成的Au納米顆粒對(duì)細(xì)胞的毒性作用具有一定的選擇性，對(duì)肝癌細(xì)胞株BEL7404具有較強(qiáng)的毒性作用，且具有濃度依賴(lài)性。但對(duì)肝正常細(xì)胞株L-02毒性較小于肝癌細(xì)胞株。進(jìn)一步將蛋白質(zhì)Au納米顆粒與MCF-7及Hela等腫瘤細(xì)胞共孵育，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該顆粒對(duì)這2種腫瘤細(xì)胞均較強(qiáng)的毒性作用。利用流式細(xì)胞術(shù)分析該納米顆粒的選擇性作用機(jī)制表明，蛋白質(zhì)Au納米顆