應(yīng)用非天然氨基酸ONBY探究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的方法研究.pdf

1、蛋白質(zhì)被譽(yù)為生命活動的主要承擔(dān)者，其在生命體中的重要性不言而喻。在研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的過程中，科研人員嘗試使用非天然氨基酸標(biāo)記蛋白質(zhì)，并利用波譜學(xué)或光譜學(xué)等方法進(jìn)行研究，時常能解決一些傳統(tǒng)方法不易解決的問題。本文嘗試對利用非天然氨基酸鄰-硝基芐基-L酪氨酸o-nitrobenzyl-O-L-tyrosine(ONBY)的方法進(jìn)行探究及應(yīng)用。
　　本文第一章中，將對非天然氨基酸的標(biāo)記方法及可以應(yīng)用的環(huán)境和方向進(jìn)行介紹。天然蛋白質(zhì)由

2、20種氨基酸組成，在這20種天然氨基酸之外，可以通過化學(xué)合成的手段構(gòu)建含有各種反應(yīng)位點(diǎn)或標(biāo)記基團(tuán)的非天然氨基酸，之后將非天然氨基酸特異性或位點(diǎn)特異性的引入到想要研究的蛋白質(zhì)中進(jìn)行反應(yīng)或觀測。而目前對于非天然氨基酸的引入方法有幾種，在蛋白質(zhì)序列的特定指定位點(diǎn)進(jìn)行特異性引入，將目的非天然氨基酸插入到序列的特定位置，通常稱為位點(diǎn)特異性引入非天然氨基酸，主要采用遺傳密碼子擴(kuò)增的方式。該方法需要在特定位點(diǎn)引入一種終止密碼子的突變(通常為琥珀密碼子

3、TAG)，該突變位點(diǎn)特異性結(jié)合一對氨酰轉(zhuǎn)運(yùn)RNA合成酶/轉(zhuǎn)運(yùn)RNA對將所需非天然氨基酸引入。如無需進(jìn)行位點(diǎn)特異性引入而希望將蛋白質(zhì)中某種特定天然氨基酸全部轉(zhuǎn)換為特定非天然氨基酸，則可以采用選擇壓力進(jìn)行引入。另外本章還對兩種不同引入方法各自應(yīng)用的領(lǐng)域及發(fā)揮的作用進(jìn)行了介紹。
　　第二章將主要對ONBY及其合成方法和實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化進(jìn)行介紹。酪氨酸殘基在包括離子通道P-loop的陽離子選擇性及基于酪氨酸的磷酸化過程等眾多蛋白質(zhì)功能中起著

4、重要作用，影響著生物體的健康及情緒。因此酪氨酸成為了一種急需要被關(guān)注和研究的氨基酸，而ONBY就是一種酪氨酸相關(guān)的非天然氨基酸。ONBY1998年由Henry A.Lester合成，用于離子通道研究，但產(chǎn)率十分低下只有大約20％。這種非天然氨基酸在結(jié)構(gòu)上酪氨酸類似，經(jīng)過一定的光照后可以發(fā)生分解反應(yīng)形成酪氨酸以及一種不溶于水的小分子鄰硝基苯甲醛，這些特性都導(dǎo)致了選擇性的引入ONBY為在體內(nèi)、體外調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)功能提供了一種有用的工具?；贠N

5、BY能夠發(fā)揮的重要作用及其目前比較低下的產(chǎn)率，我嘗試使用不同的合成方法對ONBY的合成過程進(jìn)行優(yōu)化以達(dá)到提高產(chǎn)率的作用。在獲得ONBY之后，通過對其結(jié)合和光解條件的探究以期能夠在后面的生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中更好地發(fā)揮作用。
　　在第三章中，我將介紹將ONBY特異性引入到水溶性及膜蛋白中，并對蛋白質(zhì)進(jìn)行表達(dá)、純化、光照實(shí)驗(yàn)、核磁共振檢測等一系列實(shí)驗(yàn)。繼而實(shí)際檢測采用新的合成路徑合成的ONBY是否能夠被成功地引入到蛋白質(zhì)分子中，對蛋白質(zhì)分子進(jìn)行

6、特定位點(diǎn)的標(biāo)記，并針對實(shí)際反應(yīng)時的反映效果對各類實(shí)驗(yàn)進(jìn)行反應(yīng)條件的探索及優(yōu)化。
　　第四章將對所進(jìn)行的一系列ONBY相關(guān)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果進(jìn)行總結(jié)并對后續(xù)相關(guān)實(shí)驗(yàn)及ONBY相關(guān)應(yīng)用的發(fā)展做出展望。目前，結(jié)構(gòu)生物學(xué)對于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、功能、動力學(xué)過程的研究還主要集中在通過對蛋白質(zhì)的表達(dá)、提取和純化來進(jìn)行，而位點(diǎn)特異性的引入ONBY分子（通常用于取代酪氨酸），一方面提供了一種便捷、傷害小、易于還原的標(biāo)記方式，一方面結(jié)合固體核磁共振等研究手段又可以