遼寧省規(guī)?；B(yǎng)豬場PCV2感染流行病學(xué)調(diào)查及其研究.pdf

1、本項(xiàng)目應(yīng)用現(xiàn)代分子生物學(xué)新技術(shù)，在成功建立針對PCV2基因保守序列檢測的PCR、熒光定量PCR和LAMP方法，并在對各檢測方法進(jìn)行優(yōu)化和比較的基礎(chǔ)上，結(jié)合免疫學(xué)和傳統(tǒng)病理學(xué)檢測等手段，對遼寧省豬群PCV2感染進(jìn)行了較全面系統(tǒng)的調(diào)查和研究，主要結(jié)果如下:
　　 一、參照GenBank中PCV2全基因序列，針對PCV2基因保守序列建立了分子生物學(xué)檢測技術(shù)，包括普通PCR、熒光定量PCR和LAMP方法，并對其條件進(jìn)行優(yōu)化和比較。

2、>　　 1.普通PCR方法反應(yīng)體系中引物最佳濃度為0.4μmol/L，最佳退火溫度為53℃，靈敏度為2853拷貝/μL PCV2基因組DNA，可在4h內(nèi)完成對樣品的檢測。
　　 2.熒光定量PCR方法引物和探針最佳濃度分別為0.5μmol/L和0.6μmol/L，可檢測的極限拷貝量為15拷貝/μL，較普通PCR方法靈敏度高出190倍;繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率(k)為-3.004973，截距為6.631623，其相關(guān)系數(shù)(R2)為0.

3、999212，表明該套引物和探針檢測效率極高;模板濃度在1.50×103～108拷貝/μL范圍內(nèi)，具有良好的重復(fù)性。
　　 3.LAMP方法靈敏度達(dá)1.4拷貝/μL，較熒光定量PCR方法高出10倍以上。從樣品的核酸提取到最終結(jié)果報告僅需1.5h，特別適合現(xiàn)地和基層應(yīng)用，為豬群PCV2感染的臨診檢測和流行病學(xué)調(diào)查提供了一個快速、簡便、實(shí)用的新技術(shù)。
　　 二、遼寧省規(guī)模養(yǎng)殖場豬群PCV2感染及其分子流行病學(xué)調(diào)查與分析

4、>　　 4.遼寧省規(guī)模養(yǎng)豬場PCVD臨診發(fā)病情況調(diào)查及其分析
　　 2010年度遼寧省規(guī)模養(yǎng)殖場豬群PCVD臨診場發(fā)病率為42.90％(145/338)，隨規(guī)模場養(yǎng)豬規(guī)模的擴(kuò)大，PCVD臨診場發(fā)病率呈上升趨勢。其中，基礎(chǔ)母豬存欄500頭以上規(guī)模養(yǎng)殖豬群PCVD臨診場發(fā)病率最高(54.76％),顯著高于總體平均水平(42.90％)（P＜0.05）;基礎(chǔ)母豬存欄51～100頭規(guī)模養(yǎng)殖豬群，PCVD臨診場發(fā)病率最低(33.33％)，

5、明顯低于豬群總體平均水平(42.90％)(P＜0.05)。遼寧省內(nèi)規(guī)?；B(yǎng)豬場PCVD臨診發(fā)病率具有明顯的地域性。其中，遼東地區(qū)PCVD臨診場發(fā)病率(32.81％)不但明顯低于全省總體平均水平(42.90％)(P＜0.05)，而且顯著低于其他地區(qū)（P＜0.05），與遼中地區(qū)(48.28％)差異極其顯著（P＜0.01）。
　　 5.遼寧省規(guī)?；B(yǎng)殖場豬群PCV2血清陽性率的調(diào)查與其分析
　　 應(yīng)用ELISA檢測方法，對20

6、08年-2010年，遼寧省豬群PCV2血清陽性率進(jìn)行了全面系統(tǒng)的調(diào)查研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，遼寧省豬場（或豬群）PCV2抗體場陽性率呈現(xiàn)逐年上升趨勢，至2010年，全省PCV2抗體場陽性率高達(dá)96.77％;其中，2009年遼西和遼中地區(qū)PCV2抗體場陽性率均達(dá)到100％。被分析的全省不同年度間PCV2抗體場陽性率差異顯著（P＜0.05），進(jìn)一步表明，近年來PCV2在遼寧省規(guī)?；B(yǎng)豬場的感染范圍逐年擴(kuò)大，并且存在地域性差異。
　　 不同規(guī)

7、模養(yǎng)豬場豬群血清PCV2監(jiān)測結(jié)果表明，2010年和2011年全省豬群血清PCV2抗體總體陽性率分別為68.98％(776/1125)和76.19％(1280/1680)，呈顯著上升趨勢(P＜0.05);不同地域規(guī)模養(yǎng)豬場豬群血清PCV2抗體陽性率分別在65.78％-71.11％和74.33％-78.33％之間，也呈明顯上升趨勢（P＜0.05）。表明遼寧省豬群PCV2感染范圍逐年擴(kuò)大。但不同地域間和不同規(guī)模養(yǎng)豬場間豬群血清PCV2抗體陽性

8、率均未見統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。
　　 對不同生長時期豬群調(diào)查發(fā)現(xiàn)，PCV2抗體總體陽性率為66.28％，其中，斷奶仔豬最低(47.22％)，經(jīng)產(chǎn)母豬最高(82.67％);病原總體陽性率為36.17％，哺乳仔豬最低(18.33％)，育肥豬最高(47.89％)。不同生長時期豬群血清PCV2抗體陽性率差異顯著（P＜0.05），而其PCV2病原陽性率差異極其顯著(P＜0.01)。表明遼寧省豬群PCV2感染相當(dāng)嚴(yán)重，其涉及養(yǎng)豬生產(chǎn)的

9、各個環(huán)節(jié);豬群隨著飼養(yǎng)周期的延長，其PCV2感染率也隨之升高。
　　 不同年齡、不同品系豬群血清樣品檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同品系豬群間PCV2抗體陽性率差異顯著（P＜0.05）。其中，長白豬群血清PCV2抗體陽性率最高(67.91％)，三元雜交豬群血清PCV2抗體陽性率最低(46.43％)，杜洛克豬群血清PCV2抗體陽性率低于長白和大白，但又高于二元雜交和三元雜交。表明遼寧省規(guī)?；B(yǎng)豬場豬對PCV2的易感性存在明顯的品系差異。

10、　　 6.豬群PCV2病原學(xué)監(jiān)測及與豬其他主要病毒性疫病混合感染的研究
　　 應(yīng)用熒光PCR檢測方法，對2008年-2010年患病豬群組織樣品PCV2病原學(xué)監(jiān)測結(jié)果表明，3年平均病原陽性率為54.20％，全省病原學(xué)陽性率呈逐年上升趨勢，其中，遼南和遼西上升趨勢尤為明顯(P＜0.05);表明PCV2感染在遼寧省患病豬群中十分普遍。患病豬群病毒性疫病混合感染情況監(jiān)測結(jié)果表明，2008年-2010年，遼寧省豬群以PCV2與PRRSV

11、混合感染為主，其混合感染率高達(dá)20.83％;其次是PCV2與CSFV混合感染，混合感染率為6.54％。
　　 對2010年-2012年的630份來自屠宰場的豬組織樣品進(jìn)行了病原學(xué)監(jiān)測，結(jié)果總體陽性率為53.81％，呈逐年明顯上升趨勢（P＜0.05）;隨時間推移，遼東、遼西和遼中地區(qū)病原學(xué)陽性率均呈明顯上升趨勢（P＜0.05），遼南地區(qū)和遼北地區(qū)上升趨勢極其明顯（P＜0.01）;但不同地域間未見統(tǒng)計學(xué)差異。上述結(jié)果表明，遼寧省假定

12、健康豬群中，PCV2隱性感染或/和亞臨診感染普遍存在，且感染率逐年上升，但地域間未見明顯差異。假定健康豬群的混合感染監(jiān)測還發(fā)現(xiàn)，PCV2與PRRSV總體混合感染率達(dá)13.97％，其中，遼西地區(qū)混合感染率高達(dá)20.74％，最低的遼東地區(qū)也達(dá)到7.86％。
　　 7.不同基因型PCV2在遼寧豬群中的流行情況及其分析
　　 應(yīng)用PCR方法，對2010年度來自門診的170份PCV2陽性組織病料進(jìn)行不同基因型PCV2分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)

13、,PCV2a單純感染占12.94％，PCV2b單純感染率占44.71％,二者混合感染率占42.35％。表明2010年度遼寧省內(nèi)各地區(qū)發(fā)病豬群中PCV2b為優(yōu)勢流行基因型，其形式包括CV2b單純感染和PCV2a與PCV2b混合感染。對2010年-2012年，360份來自屠宰豬PCV2陽性組織樣品檢測發(fā)現(xiàn)，PCV2a單純感染率占10.28％，PCV2b單純感染率占49.72％，二者混合感染率占40％。表明遼寧省假定健康豬群中廣泛流行的PCV

14、2也以2b基因型為主。由此可見，遼寧省各地豬群中流行的優(yōu)勢基因型為PCV2b。
　　 8.41株P(guān)CV2毒株全基因序列測定及分子遺傳演化分析
　　 應(yīng)用PCR方法和分子克隆技術(shù)，擴(kuò)增并測定了2009年-2012年41株遼寧省PCV2毒株的全基因序列，并對其分子遺傳演化進(jìn)行了系統(tǒng)分析。同源性分析表明，本研究測定的41株P(guān)CV2毒株之間同源性為94.3％～100％(:)不同年度和不同地域毒株間同源性均為94.3％-99.9％

15、。表明近4年來，遼寧省內(nèi)各地流行的PCV2毒株序列沒有明顯的地域和時序特征。被分析的41株遼寧PCV2毒株與國內(nèi)毒株間同源性高達(dá)94.5％-100％，與國外毒株間同源性為92.5％-99.6％。表明國內(nèi)、外PCV2毒株至今變異程度均不大，全球范圍內(nèi)毒株序列均沒有明顯的地域差異。進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)，41株遼寧PCV2毒株中有38株屬于PCV2b基因型，其中，1A/1B和1C亞群（型）各占19株;3株屬于PCV2a基因型，但不屬于PCV2a基因型

16、2A、2B、2C、2D及2E任一亞群;發(fā)現(xiàn)了PCV2a與PCV2b重組型病毒。表明在自然條件下，PCV2不同基因型毒株間在豬體內(nèi)存在序列重組或漂移現(xiàn)象。
　　 9.PCV2感染豬的動力學(xué)初步研究
　　 應(yīng)用ELISA和熒光PCR方法，對PCV2感染豬的動力學(xué)進(jìn)行了初步研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PCV2隱性或/和亞臨診感染嚴(yán)重的仔豬群，其PRRSV、CSF和PRV抗體陽性率均低。相關(guān)性分析表明，仔豬血清PRRS、CSF免疫抗體陽性率

17、與PCV2核酸陽性率相關(guān)性均極顯著;仔豬血清PR免疫抗體陽性率與PCV2核酸陽性率相關(guān)性顯著。表明PCV2感染在一定程度上降低了機(jī)體免疫系統(tǒng)的體液免疫功能。
　　 假定健康豬群PCV2核酸陽性率與PRRSV核酸陽性率相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，不同地域假定健康豬群PRRSV核酸陽性率與PCV2核酸陽性率雙側(cè)相關(guān)性顯著。表明PRRSV感染與PCV2感染間存在相互協(xié)同作用。
　　 病毒載量測定結(jié)果表明，種公豬在PCV2流行中可能發(fā)揮著重