rAAV2介導(dǎo)GDNF聯(lián)合早期康復(fù)訓(xùn)練治療大鼠脊髓損傷的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究目的：本實(shí)驗(yàn)以雄性SD大鼠為研究對(duì)象，造模后應(yīng)用rAAV2介導(dǎo)GDNF聯(lián)合早期康復(fù)訓(xùn)練對(duì)脊髓損傷的大鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究，采用運(yùn)動(dòng)學(xué)評(píng)分、組織形態(tài)學(xué)和免疫組化等技術(shù)，通過(guò)分析脊髓損傷大鼠在不同時(shí)間點(diǎn)后肢運(yùn)動(dòng)功能的變化、損傷脊髓處 GDNF的蛋白表達(dá)、運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元形態(tài)和數(shù)量的變化等，比較早期康復(fù)訓(xùn)練、基因治療以及這兩種因素的聯(lián)合作用對(duì)脊髓損傷大鼠恢復(fù)的影響。
　　研究方法：本實(shí)驗(yàn)采用了rAAV2介導(dǎo)GDNF基因治療、早期康復(fù)訓(xùn)練及兩者聯(lián)

2、合三種方法對(duì)脊髓重物打擊造模后的大鼠進(jìn)行干預(yù)：雄性SD大鼠90只，隨機(jī)分為假手術(shù)組（n=18）、自然愈合組（n=18）、基因治療組（n=18）、康復(fù)訓(xùn)練組（n=18）、聯(lián)合治療組（n=18），其中每組按照取材時(shí)間點(diǎn)不同隨機(jī)分為造模后7d組（n=6）、14d組（n=6）、21d組（n=6）。對(duì)基因治療組、聯(lián)合治療組大鼠造模成功后24h注射攜帶有人 GDNF基因的重組腺相關(guān)病毒。對(duì)康復(fù)訓(xùn)練組、聯(lián)合治療組大鼠在造模成功后第3d開(kāi)始早期康復(fù)訓(xùn)練

3、。測(cè)試方法與指標(biāo)：①通過(guò) BBB評(píng)分、斜板實(shí)驗(yàn)來(lái)評(píng)價(jià)脊髓損傷大鼠運(yùn)動(dòng)功能的改善。②HE染色觀察損傷后大鼠脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)數(shù)量變化。③熒光顯微鏡下觀察rAAV2-GDNF-GFP在損傷脊髓處的表達(dá)。④免疫組化實(shí)驗(yàn)采用SABC（StreptAvidin-Biotin Complex）試劑盒來(lái)檢測(cè)損傷脊髓組織中GDNF的抗原分布，觀察GDNF的蛋白表達(dá)。
　　研究結(jié)果：①運(yùn)動(dòng)學(xué)評(píng)分得出對(duì)脊髓損傷大鼠運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)，康復(fù)

4、訓(xùn)練組的效果好于基因治療組，且7d時(shí)有顯著性差異（P<0.05），14d、21d時(shí)有非常顯著性差異（P<0.01）。②HE染色切片觀察得出對(duì)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的保護(hù)作用，基因治療組要好于康復(fù)訓(xùn)練組，且在第7d時(shí)有顯著性差異（P<0.05）。③免疫組化的結(jié)果表明康復(fù)訓(xùn)練組的GDNF平均光密度值高于自然愈合組，且第7d時(shí)有顯著性差異（P<0.05），14d、21d時(shí)有非常顯著性差異（P<0.01）。④運(yùn)動(dòng)學(xué)評(píng)分、損傷后運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元存活的數(shù)量、rAAV

5、2-GDNF-GFP感染效率及GDNF的蛋白表達(dá)，聯(lián)合治療組的效果是最好的，且與其它各組相比，在7d、14d均有顯著性差異（P<0.05）。
　　研究結(jié)論：①rAAV2-GDNF-GFP在細(xì)胞水平上具有感染293T細(xì)胞能力并且可以表達(dá)GDNF蛋白，在組織水平上，損傷區(qū)脊髓組織中GDNF在轉(zhuǎn)錄和蛋白水平均有表達(dá)，其中14d時(shí)平均光密度值是最高的。②早期康復(fù)訓(xùn)練可以使大鼠后肢的運(yùn)動(dòng)功能得到明顯的改善，在7d-14d恢復(fù)較快，并且對(duì)損傷