蘋(píng)果酸脫氫酶包涵體的表達(dá)及復(fù)性研究.pdf

1、蘋(píng)果酸脫氫酶(Malate dehydrogenase,EC 1.1.1.37,MDH)是一種重要的糖代謝酶,在生物體內(nèi)特異性催化L-蘋(píng)果酸成為草酰乙酸從而完成三羧酸循環(huán).可利用MDH底物專(zhuān)一性特征,將其用于拆分DL-蘋(píng)果酸以得到重要的手性碳源D-蘋(píng)果酸.此外,MDH具有同源二聚體分子結(jié)構(gòu),這一結(jié)構(gòu)的特殊性決定了MDH常被用作于寡聚蛋白分子的結(jié)構(gòu)及功能研究的模型分子.鑒于MDH重要的經(jīng)濟(jì)及科研價(jià)值,本文以大腸桿菌蘋(píng)果酸脫氫酶(Ecoli

2、 MDH,eMDH)為研究對(duì)象,進(jìn)行了eMDH的克隆、表達(dá)及復(fù)性研究. 首先運(yùn)用PCR方法從大腸桿菌基因組DNA中擴(kuò)增出編碼eMDH的cDNA,將其與溫控質(zhì)粒載體pBV220連接構(gòu)建重組質(zhì)粒:經(jīng)限制性?xún)?nèi)切酶酶切分析及全序列分析得到陽(yáng)性重組子.繼而進(jìn)行基因工程菌培養(yǎng),42℃誘導(dǎo)外源蛋白eMDH的表達(dá).SDS-PAGE分析發(fā)現(xiàn)外源蛋白主要以不可溶的包涵體形式存在于破菌沉淀中；經(jīng)電泳凝膠光密度掃描分析得目標(biāo)蛋白表達(dá)量占全菌蛋白的42

3、﹪；包涵體蛋白的產(chǎn)量為87.3mg.(L培養(yǎng)液)<'-1>.對(duì)包涵體蛋白進(jìn)行脲及Triton洗滌純化后,蛋白純度由表達(dá)后的42﹪增加到72﹪. 在包涵體復(fù)性得研究中,重點(diǎn)考察了人工伴侶體系對(duì)eMDH包涵體的促進(jìn)復(fù)性作用.結(jié)果顯示,當(dāng)酶濃度為0.1mg·mL<'-1>,CTAB與β-環(huán)糊精的濃度比為0.6mmol·L<'-1>:4.8mmol·(1:8),pH值為7.6,變性劑脲終濃度為0.32 mol·L<'-1>及5mmol

4、·L<'-1> DTT存在時(shí),人工伴侶可有效輔助eMDH復(fù)性,復(fù)性后的比活可達(dá)160U/mg. 利用熒光光譜法、圓二色光譜法分析表明,復(fù)性后的eMDH具有正確的分子結(jié)構(gòu).體積排阻色譜分析證明,其比自發(fā)復(fù)性的eMDH含有更多的二聚體分子. 另外,溫度動(dòng)力學(xué)結(jié)果顯示,低溫有利于降低eMDH分子的折疊反應(yīng)速率,提高eMDH的復(fù)性比活；與自發(fā)復(fù)性相比,人工伴侶輔助復(fù)性體系,可以降低eMDH的折疊速率,有效協(xié)助eMDH折疊為正