水稻NADP-蘋果酸酶與逆境關(guān)系的研究.pdf

1、NADP-蘋果酸酶(NADP-ME)是在二價金屬離子存在下催化對蘋果酸氧化脫羧生成丙酮酸、CO2、NADPH反應(yīng)的酶，它廣泛地存在于動物、植物、細(xì)菌等生物體中，參與多種代謝，是生物體生命活動中重要的酶之一。本研究室在前期的研究中，針對我國東北地區(qū)的蘇打鹽堿地的碳酸鹽逆境(NaHCO3，Na2CO3)為研究對象，采用分子生物學(xué)手法，在碳酸鹽逆境下克隆了水稻的NADP-ME2基因(GeneBankAccessionNo.AB053295)。

2、本論文以水稻(OryzasativaL.)為材料，對水稻的NADP-ME與逆境關(guān)系做了探討研究。目前報道水稻的NADP-ME有四種同工酶，為了深入了解各同工酶與逆境的關(guān)系，本研究對水稻NADP-ME的四種同工酶在逆境下的表達(dá)特性及差別進(jìn)行了比較性研究，也探討了在逆境下水稻的地上部與地下部NADP-ME的酶活性的變化規(guī)律。為了進(jìn)一步明確NADP-ME同工酶之間特性的差異，本研究利用大腸桿菌表達(dá)體系，通過GST融合蛋白純化了二個水稻NADP

3、-ME蛋白，在體外對其酶的生物化學(xué)特性進(jìn)行了比較研究。在酵母表達(dá)體系中表達(dá)水稻的NADP-ME基因后，初步對其抗逆性進(jìn)行了探討。主要得到了如下結(jié)果： 1、分析得到四種水稻NADP-ME同工酶之間的同源性都超過75％，氨基酸序列有較高的相似性。利用PSORT(Predictionofproteinlocalizationsites)分析的結(jié)果：NADP-MEi在N-末端帶有質(zhì)體轉(zhuǎn)酶肽，被預(yù)測存在于葉綠體；而NADP-ME2、NAD

4、P-ME3被分別預(yù)測定位于細(xì)胞膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，NADP-ME4是定位細(xì)胞質(zhì)中。我們用綠色熒光蛋白(GFP蛋白)分子標(biāo)記方法在遺傳轉(zhuǎn)化的擬南芥中探討了NADP-ME2在細(xì)胞的的定位情況，結(jié)果表明，NADP-ME2-GFP融合蛋白在遺傳轉(zhuǎn)化的擬南芥根細(xì)胞的細(xì)胞膜部位大量表達(dá)，這表明了NADP-ME2在植物體中存在于細(xì)胞膜。預(yù)測及實驗的結(jié)果表明水稻的NADP-ME四種同工酶存在于細(xì)胞內(nèi)不同的亞細(xì)胞內(nèi)起著功能，各自扮演著不同的角色。 2、用

5、Northern雜交方法對水稻NADP-ME基因的表達(dá)特性研究。首先對水稻NADP-ME2的表達(dá)做了解析，在正常的條件下，水稻的葉、莖中NADP-ME2的mRNA表達(dá)量較高，而在根中則較低，NADP-ME2基因的mRNA表達(dá)不受光的誘導(dǎo)，表明NADP-ME2可能是水稻非光合型的NADP-ME。然而，水稻質(zhì)體型NADP-ME1(C3植物質(zhì)體型NADP-ME)基因的表達(dá)卻受光的誘導(dǎo)，這些結(jié)果未見報道。在NaCl、NaHCO3、Na2CO3、

6、10％PEG逆境處理下，水稻NADP-ME2基因的表達(dá)量明顯地增高，表明水稻的NADP-ME2基因表達(dá)與逆境存在著應(yīng)答關(guān)系。用半定量RT-PCR的方法對四種水稻NADP-ME基因與逆境應(yīng)答關(guān)系進(jìn)行了探討，表明水稻不同NADP-ME基因?qū)Νh(huán)境逆境信號產(chǎn)生了不同應(yīng)答反應(yīng)特性。 3、通過天然活性電泳及NADP-ME特異酶活性染色方法，從水稻中檢測出四種NADP-ME同工酶，這一結(jié)果和以前報道的不完全相同(在C3植物中僅檢測出一條NAD

7、P-ME特異帶)。在NaHCO3、Na2CO3、NaCl及PEG6000逆境下，水稻NADP-ME特異酶活性都明顯的增高，從蛋白表達(dá)水平上進(jìn)一步表明了水稻的NADP-ME與逆境存在著顯著的應(yīng)答關(guān)系。 4、水稻NADP-ME2、NADP-ME3同工酶本身的酶學(xué)特性的比較：在BL21菌株中成功地表達(dá)了兩個水稻NADP-ME基因的融合蛋白，在分離、純化后，得到了具有生物活性的NADP-ME2、NADP-ME3的重組蛋白，對NADP-M

8、E2、NADP-ME3重組蛋白酶學(xué)特性進(jìn)行了比較研究表明：NADP-ME2、NADP-ME3基因在BL21菌株中蛋白表達(dá)量存在明顯地差異，NADP-ME2表達(dá)量較低，而NADP-ME3的表達(dá)量較高；不同的酶促動力學(xué)特性，NADP-ME2對L-Malate的親和力要高于NADP-ME3，而NADP-ME3對NADP的親和力要高于NADP-ME2，這表明NADP-ME2、NADP-ME3在利用L-Malate、NADP兩種底物的水平存在著明

9、顯地差異。此外，NADP-ME2和NADP-ME3融合蛋白對L-Malate底物的Vmax遠(yuǎn)比NADP要大得多。以上結(jié)果表明了水稻植物體中的NADP-ME同工酶是存在差異的。 5、NADP-ME2及NADP-ME3在酵母表達(dá)體系中抗鹽性初步探討，從基因轉(zhuǎn)錄及蛋白表達(dá)水平上，探討了水稻NADP-ME與逆境有明顯的應(yīng)答關(guān)系。由于酵母是真核生物，與植物相比有類似的代謝途徑，把水稻NADP-ME2及NADP-ME3基因構(gòu)建在酵母表達(dá)載體