乳酸菌的蘋果酸-乳酸酶基因的克隆和在大腸桿菌中的表達(dá).pdf

1、蘋果酸-乳酸酶是乳酸菌中控制蘋果酸-乳酸發(fā)酵的關(guān)鍵酶，利用基因工程方法構(gòu)建可降解蘋果酸的酵母工程菌，試圖由工程菌同步完成酒精發(fā)酵和蘋果酸乳酸發(fā)酵，這不僅提高葡萄酒的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和感官質(zhì)量，簡(jiǎn)化釀酒工序，降低生產(chǎn)成本，提高酒的生物穩(wěn)定性，而且克服乳酸菌添加給葡萄酒質(zhì)量帶來(lái)的各種副效應(yīng)；除此之外，構(gòu)建工程菌的過(guò)程可深化對(duì)微生物降酸機(jī)理的理解，豐富和發(fā)展釀造理論，經(jīng)濟(jì)有效的控制降酸過(guò)程。 本文提取乳酸乳球菌乳酸亞種(Lactococcu

2、s lactis subsp.lactis)1.18、葡萄酒明串珠菌(Leuconostoc oenos)6057、乳酸乳球菌乳脂亞種(Lactococcus lactissubsp．cremoris)1.9、嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus)1.2471和德氏乳桿菌保加利亞亞種(Lactobacillus delbrueckii subsp．bulgaricus)1.1480 的基因組DNA，通過(guò)PCR

3、方法從1.18菌株和6057菌株中分離到MLE基因，并克隆到pGEM-T Easy載體，分別構(gòu)建了pT-mlel.18和pT-mle6057克隆載體，測(cè)序結(jié)果表明：1.18菌株的mle(GenBank中注冊(cè)號(hào)為DQ667006)含有1623個(gè)堿基的完整閱讀框， 6057菌株的mle(OenBank中注冊(cè)號(hào)為DQ667004)含有1626個(gè)堿基的完整的閱讀框。在NCBI進(jìn)行BLAST分析，1.18菌株mle序列與4種已注冊(cè)的Lactoco

4、ccus lactis mle基因序列比較，即與ILl441序列和ILl403序列的同源性達(dá)99.1﹪，與MG1363序列的同源性達(dá)96.8﹪。6057菌株mle序列與其中兩種已注冊(cè)的Oenococcus oeni mle基因序列比較，即與AY786176(GenBank序列號(hào))序列同源性達(dá)99.7﹪，與AB235202(GenBank序列號(hào))序列同源性達(dá)99.3﹪。 將1.8菌株mle序列與1976年保存的一株乳酸乳球菌乳酸

5、亞種Lactococcus lactis subsp．lactisl．18的mle序列(GenBank注冊(cè)號(hào)為DQ667005)進(jìn)行比對(duì)，同源性達(dá)98.8﹪。有18個(gè)堿基差異，主要是堿基A和T的變化，其中55.5﹪的A變成G，80﹪的T變成A。編碼10個(gè)新的氨基酸，這些氨基酸均在保守區(qū)之外。 用SalI酶從pT-mlel.18載體上將mle目的片段切下，克隆到大腸桿菌pET-28a表達(dá)載體，構(gòu)建了pET-mle表達(dá)載體。用Ca