α-Actinins對足細胞運動性的影響機制.pdf

1、第一部分α-Actinins在足細胞骨架結(jié)構(gòu),運動性和牽拉力中的作用
　　目的:觀察α-actinins基因敲低及突變后足細胞骨架結(jié)構(gòu)的變化及對足細胞運動性和牽拉力的影響。
　　方法:體外培養(yǎng)條件永生化的野生型及α-actinin-4 K256E基因雜合和純合突變型足細胞。利用慢病毒轉(zhuǎn)染RNA干擾技術(shù)敲低野生型足細胞中α-actinin-1和α-actinin-4的表達;應(yīng)用Western Blot檢測轉(zhuǎn)染效果;免疫熒光觀察

2、細胞形態(tài),α-actinins及細胞骨架結(jié)構(gòu)F-actin的分布變化;傷口愈合實驗用于檢測細胞的運動性;牽拉力學顯微鏡用于檢測細胞的牽拉力。
　　結(jié)果:Western Blot結(jié)果顯示慢病毒轉(zhuǎn)染小干擾RNA技術(shù)可高效敲低α-actinin-1和α-actinin-4基因。α-Actinin-1和α-actinin-4基因敲低后,細胞骨架出現(xiàn)紊亂,細胞的牽拉力增加,而且細胞的運動性也增加。相反,α-actinin-4突變型的足細胞表

3、現(xiàn)為牽拉力下降,運動性降低。
　　結(jié)論:α-Actinins參與細胞骨運動性。α-Actinin-4突變的足細胞可獲得架結(jié)構(gòu)重排和牽拉力形成,可調(diào)節(jié)足細胞的收縮力和限制細胞的某些功能而降低了細胞的牽拉力和運動性。這表明α-actinins功能的改變可能通過改變足細胞的牽拉力和運動性造成腎小球損傷。
　　第二部分α-Actinins基因敲低或突變對足細胞黏著斑的影響
　　目的:觀察體內(nèi)外α-actinins基因敲低及突變

4、后對細胞間黏附分子vinculin和β3 integrin mRNA及蛋白表達水平的影響。
　　方法:間接免疫熒光法檢測α-actinin-1和α-actinin-4敲低后vinculin,F-actin的表達分布變化,及活性β3 integrin在野生型,α-actinin-4基因敲除,及α-actinin-4 K256E基因雜合和純合突變型小鼠中的表達變化。實時定量PCR及Western Blot檢測vinculin在α-ac

5、tinins基因敲低及突變型足細胞中mRNA及蛋白表達水平的變化。另外,實時定量PCR也檢測了β3 integrin在上述幾種細胞中mRNA表達水平的變化。
　　結(jié)果:Vinculin在α-actinin-4基因敲低足細胞中mRNA及蛋白表達水平均有增高,但在α-actinin-1基因敲低和α-actinin-4突變足細胞中表達無明顯變化。β3 Integrin在α-actinin-4突變型足細胞中mRNA表達水平明顯下降。在α-

6、actinin-4基因敲除小鼠腎組織中,活性β3 integrin表達增加,而在α-actinin-4雜合型和純合型突變的小鼠腎組織中,活性β3 integrin的表達下降。
　　結(jié)論:α-Actinin-4敲低可影響vinculin的表達,而α-actinin-4基因敲除和突變可明顯影響小鼠腎臟活性β3 integrin的表達。這表明α-actinins可影響足細胞黏著斑的表達。
　　第三部分α-Actinins基因敲低或

7、突變對小GTP酶活性的影響
　　目的:觀察α-actinins基因敲低及突變后對小GTP酶活性的影響,同時觀察野生型,α-actinin-4 K256E基因雜合和純合突變小鼠腎臟中小GTP酶活性的變化。
　　方法:利用小GTP酶活性試劑盒檢測α-actinins基因敲低及突變型足細胞中RhoA, Rac1和Cdc42的活性,并同時檢測野生型,α-actinin-4基因雜合及純合型突變小鼠腎臟裂解液中上述三種小GTP酶的活性。

8、
　　結(jié)果:在α-actinin-4基因敲低細胞中,RhoA活性顯著下降,Cdc42的活性明顯增高,而Rac1活性則無明顯變化。在α-actinin-1基因敲低細胞中,RhoA活性也有所增加,Rac1和Cdc42活性則無變化。在α-actinin-4基因突變細胞中,雜合型和純合型α-actinin-4細胞中RhoA活性均有所增加,而Rac1和Cdc42活性則無變化。同時純合型α-actinin-4突變小鼠腎臟中RhoA活性也有所增