L-半胱氨酸對細菌產(chǎn)氫過程的促進作用.pdf

1、有機廢水發(fā)酵法生物制氫技術(shù)以其環(huán)境友好并產(chǎn)生清潔能源的特點，逐漸成為環(huán)境生物技術(shù)領(lǐng)域的研究熱點之一。近年來，隨著不同種屬的產(chǎn)氫細菌被分離純化、不同形式的制氫反應器被研發(fā)、產(chǎn)氫細菌的培養(yǎng)條件得到優(yōu)化以及分子生物學技術(shù)的引入，發(fā)酵法生物制氫技術(shù)理論逐漸得到發(fā)展完善。生產(chǎn)性示范工程的調(diào)試和運行更是為生物制氫技術(shù)的推廣應用打下基礎。然而如何提高產(chǎn)氫效率、降低生產(chǎn)成本、穩(wěn)定運行反應器仍是該技術(shù)工業(yè)化得到應用需要解決的問題。一直以來，研究人員嘗試采

2、用各種方法提高產(chǎn)氫效率。本研究選擇L-半胱氨酸作為產(chǎn)氫促進劑，一方面因為 L-半胱氨酸是一種良好的還原劑；另一方面 L-半胱氨酸具有巰基，而巰基是氫化酶的官能團之一。因此，研究L-半胱氨酸促進產(chǎn)氫細菌的生長、產(chǎn)氣、代謝以及作用機制，對于提高細菌的產(chǎn)氫能力有重要的意義，對于研究其它提高產(chǎn)氫速率的方法具有借鑒作用，同時對于深化產(chǎn)氫理論有一定的參考價值。
　　針對 L-半胱氨酸對于產(chǎn)氫細菌的影響，本文從細菌純培養(yǎng)、混合培養(yǎng)等角度進行研究

3、，通過分批培養(yǎng)、連續(xù)流培養(yǎng)等手段考察 L-半胱氨酸對細菌產(chǎn)氫效能的促進作用。同時利用Real-Time PCR技術(shù)，實現(xiàn)了氫化酶表達的定量檢測，更加準確的描述了 L-半胱氨酸的促氫作用機制，也為其他產(chǎn)氫細菌靶基因的定量表達方法提供參考。
　　選擇乙醇型發(fā)酵中優(yōu)勢種群的模式菌株產(chǎn)乙醇桿菌 YUAN-3進行考察，優(yōu)化了 YUAN-3的生長條件，在含有緩沖體系的培養(yǎng)基初始 pH為6.0時，YUAN-3的平均產(chǎn)氫速率和比產(chǎn)氫率都達到最大，

4、分別為5.75 mmolH2/g-CDW·h和2.32 molH2/mol-葡萄糖。在初始pH7.0時，細胞干重達到最大，為0.59g/L-培養(yǎng)基。
　　對于產(chǎn)氫細菌 YUAN-3的分批培養(yǎng)顯示適量添加 L-半胱氨酸可以促進發(fā)酵細菌的生長和產(chǎn)氫，并提高底物利用能力。細胞干重隨著 L-半胱氨酸濃度的增加而增加，當L-半胱氨酸濃度為1.5g/L時，生物量達到最大為0.53g/L-培養(yǎng)基，產(chǎn)生的氫氣量在 L-半胱氨酸為0.8g/L時達到

5、最大值為1995 mL/L-培養(yǎng)基。實測數(shù)值和用matlab模擬修正的Gompertz方程證明了L-半胱氨酸的添加加速了YUAN-3的產(chǎn)氣過程。
　　L-半胱氨酸的流加迅速降低了反應器內(nèi)部的ORP，促進了乙醇型發(fā)酵的形成，提高了產(chǎn)氫速率、生物量，并提高了微生物產(chǎn)氫活性。流加 L-半胱氨酸的反應器在14d后開始形成逐漸典型的代謝產(chǎn)物，此后其優(yōu)勢越來越明顯。未流加 L-半胱氨酸反應器在啟動20d以后才形成以乙酸、乙醇為主要代謝產(chǎn)物的乙

6、醇型發(fā)酵。在啟動的第1d，流加L-半胱氨酸的反應器的ORP就立即下降到-400mv左右，而未流加 L-半胱氨酸的反應器內(nèi)的ORP下降至此需要10d以上。在啟動結(jié)束時，未流加和流加 L-半胱氨酸的反應器平均產(chǎn)氫速率分別為2.74 L/d和2.81 L/d，生物量分別為為9.5g/L和10.1g/L。
　　從細胞水平和分子水平分別考察 L-半胱氨酸促進產(chǎn)氫作用機制。結(jié)果表明，L-半胱氨酸在促進 YUAN-3產(chǎn)氫過程中促進了碳源的利用，

7、并發(fā)揮了還原劑的作用，同時還促進了 YUAN-3的凝集能力，但L-半胱氨酸不能緩解產(chǎn)物的反饋抑制。用特異引物對氫化酶表達進行定量分析，擴增結(jié)果表明，添加L-半胱氨酸后，氫化酶基因表達增強，在 L-半胱氨酸的濃度為0.8 g/L-培養(yǎng)基時，氫化酶基因表達可達2.72×107拷貝數(shù)/μL。L-半胱氨酸的添加使等蛋白情況下乙醇脫氫酶的活性減弱，但由于生物量的增加和單位生物量產(chǎn)生蛋白質(zhì)濃度的增加，添加 L-半胱氨酸后乙醇的產(chǎn)量仍逐漸增加。綜上分