茶枝柑及近緣種的分子鑒別研究.pdf

1、目的:
　　茶枝柑為蕓香科(Rutacae)柑橘屬(Citrus)植物，其外層果皮制干，陳化3年以上即為廣陳皮，具有理氣健脾、和胃止嘔、燥濕化痰、疏肝利膽、解結化癰等多種功效。其果肉富含糖類、有機酸、天然維生素等營養(yǎng)物質，同時可作為陳皮茶、添加劑和香料等，具有很高的食用價值。作為廣東道地藥材的廣陳皮，是臨床用藥的首選藥材，開發(fā)前景廣闊。但由于廣陳皮與一般陳皮在市場上價格差異極大，因此市場上多有一般陳皮冒充廣陳皮的現象。陳皮與廣陳皮

2、的區(qū)分主要以產地來分的，廣陳皮主產于廣東新會、四會等地，陳皮則主產于福建、湖南、江西、重慶、湖北、四川等地。而現有的性狀、顯微等鑒別方法以及檢測陳皮指標性成分等，不適于快速準確鑒別廣陳皮與一般陳皮。因此為確保陳皮藥材質量穩(wěn)定可控和臨床用藥安全有效，建立快速準確鑒別茶枝柑與其他柑橘品種的方法是亟待解決的問題。
　　方法:
　　本研究采用了ISSR分子標記對茶枝柑及近緣種共38份材料進行區(qū)分;對比SCoT分子標記和ISSR分子標

3、記的鑒別優(yōu)勢;同時探索SCoT結合克隆測序對物種鑒定的可行性;尋找適合茶枝柑及近緣種鑒別的通用條形碼;以及嘗試在分子角度上區(qū)分茶枝柑的駁枝和芽枝;最后對茶枝柑果皮的DNA提取方法優(yōu)化，嘗試對比不同貯存年限茶枝柑果皮的DNA含量變化，將茶枝柑果皮與葉的基因序列進行對比驗證，以期為今后市場上流通的各類陳皮進行準確鑒別。
　　結果:
　　1.采用L16正交設計法對茶枝柑的ISSR反應體系進行優(yōu)化，最終優(yōu)化結果為1×PCR buff

4、er,1.5mmol/L Mg2+,0.2mmol/L dNTPs,0.3μ mol/L primer,0.5U Taq酶，50ng模板DNA。通過篩選退火溫度及多態(tài)性驗證后，篩選了11條ISSR引物，共擴增了2126條條帶，多態(tài)性達到100％，同時通過UPGMA聚類分析將茶枝柑及近緣種38份材料在相似系數0.54～0.94水平上得以區(qū)分。
　　2.探討了SCoT分子標記對比ISSR分子標記的優(yōu)勢以及結合分析效果。以L25正交方法

5、對SCoT反應體系進行優(yōu)化得到最佳體系為1×PCR buffer，2mmol/L Mg2+，0.25mol/L dNTPs，0.625μ mol/L primer，0.5U Taq酶，20ng模板DNA。最終篩選出了12條引物對38份茶枝柑及近緣種遺傳多態(tài)性分析，共擴增了2846條條帶，多態(tài)位點百分率占98.7％。在相似系數為0.54～0.91水平上38份材料得以區(qū)分。因此不管是SCoT還是ISSR分子標記均能將38份供試材料分開，雖有

6、一定的差異，但是從總體上來看結果大致相同，說明SCoT和ISSR分子標記是進行茶枝柑及近緣種分子鑒定的有效工具。
　　3.SCOT分子標記結合克隆測序對茶枝柑及近緣種進行了序列比對分析，同源性為63.84％，而遺傳距離則在0.001～0.654之間，基于Kimura遺傳距離分析材料間的Phylogenetic Tree發(fā)現聚為三類，每一種供試材料都存一個或多個突變位點可以作為特異位點與其他供試材料區(qū)分開。因此驗證了SCoT分子標記

7、技術結合克隆測序在茶枝柑及近緣種的分子鑒別研究是有效的。
　　4.通過4條國際通用條形碼對茶枝柑及近緣種的篩選鑒別，其中marK序列測序成功率為50％，rbcL序列變異位點為0，而BLAST比對發(fā)現ITS2和psbA-trnH鑒別效率均為100％，因此最終選用了ITS2和psbA-trnH序列作為材料鑒別條形碼，通過組合序列分析材料區(qū)分度高于單條形碼，因此推薦ITS2+psbA-trnH序列作為茶枝柑及近緣種的鑒別序列。
　

8、　5.在分子水平上對茶枝柑駁枝和芽枝區(qū)分，通過4條國際條形碼篩選，其中ITS2、psbA-trnH和matK序列中均未發(fā)現差異位點，而在rbcL序列上芽枝和駁枝得以完全區(qū)分，為茶枝柑選苗選育上提供了廣泛前景及應用價值。
　　6.建立了cCTAB法作為茶枝柑果皮的有效提取方法，較試劑盒法提高了十倍多產率，而不同貯存年限茶枝柑果皮DNA含量與時間并無明顯關聯。通過茶枝柑果皮與其葉的psbA-trnH序列比對發(fā)現完全一致，進一步驗證了D

9、NA條形碼的鑒定優(yōu)勢。
　　結論:
　　ISSR分子標記結合SCoT分子標記的遺傳多態(tài)性高，茶枝柑及近緣種在UPGMA聚類樹幾乎完全得以區(qū)分。SCoT分子標記結合克隆測序得到多個變異位點，可以作為材料的區(qū)分位點。ITS2結合psbA-trnH序列適合作為茶枝柑及近緣種的條形碼鑒別序列。rbcL序列水平上可將兩種繁育方式的茶枝柑完全得以區(qū)別。cCTAB法能有效提取10年以上茶枝柑果皮DNA，同時通過psbA-trnH序列比對，