激活第Ⅲ組代謝型谷氨酸受體對Aβ31-35所致神經(jīng)毒的作用觀察.pdf

1、Alzheimerdisease(AD)是一種以老年斑、神經(jīng)纖維纏結(jié)、神經(jīng)元死亡為特征性病理改變，以記憶減退、認(rèn)知障礙、人格改變?yōu)橹饕R床表現(xiàn)的神經(jīng)退行性疾病。其病理和發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，雖然學(xué)說很多，但確切機(jī)制不明，因而缺乏對AD有效的預(yù)防及治療。在眾多AD病因?qū)W說中，Aβ沉積被認(rèn)為是最重要的發(fā)病機(jī)制。Aβ是由39-43個氨基酸組成的具有β折疊結(jié)構(gòu)的小肽，它們在細(xì)胞外沉積，聚集會形成不溶性多肽，產(chǎn)生對神經(jīng)元的毒害作用。臨床病理資料證實(shí)，Aβ

2、是AD患者老年斑的主要成份，而老年斑是AD患者的特征性病理改變，也是病理上診斷AD的重要指標(biāo)。越來越多的實(shí)驗(yàn)證據(jù)證實(shí)，完整肽鏈(Aβ1-42)和Aβ25-35片段對離體培養(yǎng)的神經(jīng)元具有毒性作用，其機(jī)制包括：通過產(chǎn)生自由基發(fā)揮對細(xì)胞的損傷作用；通過增強(qiáng)谷氨酸的神經(jīng)毒作用，如過度激活NMDA受體，產(chǎn)生對細(xì)胞的損傷；通過誘導(dǎo)NO對細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用；通過刺激產(chǎn)生炎癥，由活化的小膠質(zhì)細(xì)胞和過度表達(dá)的細(xì)胞因子產(chǎn)生損傷作用；通過影響胞內(nèi)Ca2+穩(wěn)態(tài)產(chǎn)

3、生鈣超載而引起神經(jīng)元的損傷；以及通過細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)神經(jīng)元死亡。新近的資料顯示，Aβ31-35，一個更小的Aβ片段也能產(chǎn)生與完整肽鏈及Aβ25-35相同的神經(jīng)毒作用，提示Aβ31-35可能是Aβ肽鏈最短的活性肽段或關(guān)鍵的活性部位。 谷氨酸是中樞神經(jīng)系統(tǒng)主要的興奮性遞質(zhì)，其受體可分為離子型谷氨酸受體(inotropicglutamatereceptors，iGluRs)和代謝型谷氨酸受體(metabotropicglutamatere

4、ceptors，mGluRs)。代謝型谷氨酸受體是一個與G-蛋白偶聯(lián)的受體家族，激活后通過產(chǎn)生第二信使而發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)。依據(jù)代謝型谷氨酸受體氨基酸序列的同源性、胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制及藥理學(xué)特性，將其分為三組共8型。其中第Ⅰ組mGluRs包括mGluR1和mGluR5，主要位于突觸后，通過激活PLC產(chǎn)生IP3、DG發(fā)揮作用，通常表現(xiàn)為與離子型受體如NMDA受體類似的作用。第Ⅱ組mGluRs(包括mGluR2和mGluR3)，尤其是第Ⅲ組mG

5、luRs(mGluR4,mGluR6，mGluR7，mGluR8)主要位于突觸前，它們通過與Gi蛋白偶聯(lián)而抑制cAMP的生成，表現(xiàn)為對谷氨酸釋放的負(fù)反饋調(diào)節(jié)，即通過突觸前機(jī)制抑制谷氨酸釋放，防止谷氨酸過量，從而發(fā)揮可能的神經(jīng)保護(hù)作用。Bruno等最近的報(bào)道顯示，在離體實(shí)驗(yàn)的條件下，第Ⅲ組mGluRs激動劑對離體培養(yǎng)的神經(jīng)細(xì)胞的損傷發(fā)揮了保護(hù)作用；Copani等發(fā)現(xiàn)激活第Ⅲ組mGluRs對由Aβ25-35誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡有保護(hù)作用。有鑒于

6、此，本實(shí)驗(yàn)擬進(jìn)行以下幾方面觀察：1、Aβ31-35對離體培養(yǎng)的大鼠皮層神經(jīng)元的致凋亡作用；2、第Ⅲ組mGluRs激動劑L-SOP和(R，S)-PPG對Aβ31-35誘導(dǎo)的培養(yǎng)神經(jīng)元致凋亡作用的觀察；3、探討激活第Ⅲ組mGluRs抑制Aβ31-35致凋亡的機(jī)制；4、第Ⅲ組mGluRs激動劑對Aβ31-35誘導(dǎo)的培養(yǎng)神經(jīng)元的胞內(nèi)Ca2+濃度的影響。 第一部分Aβ31-35對離體培養(yǎng)神經(jīng)元的致凋亡作用取新生Wistar大鼠大腦皮層神經(jīng)

7、元，選擇培養(yǎng)狀態(tài)好，即折光性及活性強(qiáng)的細(xì)胞做進(jìn)一步的觀察。結(jié)果說明Aβ的小片段31-35與完整的Aβ片段一樣，可引起體外培養(yǎng)神經(jīng)元的凋亡，具有相似的生物活性，即對神經(jīng)元具有毒性作用，這與本實(shí)驗(yàn)室過去的研究結(jié)果相一致。 第二部分第Ⅲ組代謝型谷氨酸受體激動劑對Aβ31-35誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡的保護(hù)作用。在證實(shí)Aβ31-35致凋亡作用的基礎(chǔ)上，觀察了第Ⅲ組mGluRs激動劑L-SOP和(R，S)-PPG對Aβ31-35所致神經(jīng)元凋亡的保

8、護(hù)作用。結(jié)果表明，第Ⅲ組mGluRs激動劑L-SOP和(R，S)-PPG對Aβ31-35誘導(dǎo)的培養(yǎng)神經(jīng)元的凋亡具有保護(hù)作用，其保護(hù)作用呈劑量依賴性，當(dāng)?shù)蜐舛葧r(10μM)無保護(hù)作用，隨著濃度的增加，其保護(hù)作用明顯增強(qiáng)(效應(yīng)在100μM)。 第三部分激活第Ⅲ組代謝型谷氨酸受體拮抗Aβ31-35毒性作用的機(jī)制。探討前期的實(shí)驗(yàn)觀察證實(shí)，應(yīng)用第Ⅲ組mGluRs激動劑L-SOP和(R，S)-PPG可抑制Aβ31-35所致的神經(jīng)元凋亡，在此

9、基礎(chǔ)上利用同樣的實(shí)驗(yàn)條件，即離體培養(yǎng)的皮層神經(jīng)元，通過測定caspases酶系統(tǒng)(包括caspases-3、-8、-9)的活性和流式細(xì)胞檢測細(xì)胞凋亡率，結(jié)合應(yīng)用PKA的激動劑Sp-cAMP和抑制劑Rp-cAMP，探討激活第Ⅲ組mGluRs抑制Aβ31-35致凋亡的機(jī)制。結(jié)果表明，1.Aβ31-35通過激活內(nèi)、外兩條途徑誘導(dǎo)培養(yǎng)皮層神經(jīng)元凋亡；2.應(yīng)用L-SOP，(R，S)-PPG激活第Ⅲ組mGluRs既可抑制內(nèi)源性途徑、也可抑制外源性途

10、徑引起的凋亡；3.激活胞內(nèi)PKA系統(tǒng)也可介導(dǎo)Aβ31-35的神經(jīng)毒作用，抑制該系統(tǒng)則具有神經(jīng)保護(hù)作用；4.激活第Ⅲ組mGluRs，通過抑制cAMP-PKA系統(tǒng)使該系介導(dǎo)的Aβ31-35致凋亡也受到抑制，因而對神經(jīng)元發(fā)揮保護(hù)作用。 第四部分第Ⅲ組代謝型谷氨酸受體激動劑對Aβ31-35所致神經(jīng)元[Ca2+]i升高作用的影響。細(xì)胞內(nèi)Ca2+的動態(tài)平衡是細(xì)胞進(jìn)行各項(xiàng)功能活動的基本條件之一，同樣對于神經(jīng)元的生長發(fā)育、突觸傳遞及神經(jīng)元的代謝