類桿菌的PCR鑒定及其生物信息學(xué).pdf

1、目的： 設(shè)計(jì)通用引物和通用探針，使用聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)(普通PCR，實(shí)時(shí)熒光定量PCR)快速鑒定類桿菌屬細(xì)菌，并測(cè)定該菌屬的16s rRNA基因序列，建立基因進(jìn)化樹，分析不同來源分離菌株之間的進(jìn)化差異、分離菌株和標(biāo)準(zhǔn)菌株之間的進(jìn)化差異。 研究方法： 1．根據(jù)臨床上常見類桿菌的標(biāo)準(zhǔn)16S rRNA基因序列，在其序列保守區(qū)設(shè)計(jì)通用引物和通用探針，并驗(yàn)證引物和探針的特異性。2．使用脆弱類桿菌、多形類桿菌、普通類桿菌、卵圓

2、類桿菌為陽(yáng)性對(duì)照株(共13株)，以腸道需氧菌、G<'+>球菌、梭桿菌、長(zhǎng)雙歧桿菌DQ259034、大腸埃希菌ATCC25922(共45株)，及人類單個(gè)核細(xì)胞基因組DNA、HBV-DNA等為陰性對(duì)照，建立普通PCR和實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法，快速鑒定類桿菌。3．普通PCR產(chǎn)物基因測(cè)序，所測(cè)序列之間以及和相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)株16S rRNA基因序列之間做比對(duì)，構(gòu)建基因進(jìn)化樹。4．采用細(xì)菌直接計(jì)數(shù)法制作標(biāo)準(zhǔn)品建立實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，同時(shí)和PCR產(chǎn)

3、物作為標(biāo)準(zhǔn)品的定量檢測(cè)同一標(biāo)本的結(jié)果比較。5．類桿菌的PCR鑒定結(jié)果和表型鑒定結(jié)果對(duì)比分析。 結(jié)果： 1．建立了普通PCR和實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系。普通PCR和實(shí)時(shí)熒光定量PCR能特異的檢測(cè)脆弱類桿菌，多形類桿菌，普通類桿菌，卵圓形類桿菌。而40株腸道需氧菌、G<'+>球菌、梭桿菌、長(zhǎng)雙歧桿菌D0259034、大腸埃希菌ATCC25922、人類單個(gè)核細(xì)胞基因組DNA、HBV-DNA等無電泳條帶和檢測(cè)信號(hào)出現(xiàn)。

4、 2．普通PCR能檢測(cè)到100個(gè)細(xì)菌的基因組DN/μl，實(shí)時(shí)熒光定量：PCR能檢測(cè)到10個(gè)細(xì)菌的基因組DN/μl。 3．做了實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)類桿菌的批內(nèi)和批間重復(fù)性實(shí)驗(yàn)。用細(xì)菌濃度分別為10<'4>、10<'5>個(gè)細(xì)菌基因組/μl，做批內(nèi)，批間重復(fù)性實(shí)驗(yàn)，每個(gè)濃度測(cè)5次，使用ct(循環(huán)域值)值的變異系數(shù)表示實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性。10<'4>個(gè)細(xì)菌基因組/μl的批內(nèi)重復(fù)性：CV(變異系數(shù))值為0.704﹪，批間重復(fù)性CV值為3.49

5、﹪；10<'5>個(gè)細(xì)菌基因組仙的批內(nèi)重復(fù)性：CV值為0.74﹪，批間重復(fù)性CV值為1.19﹪。 4.用細(xì)菌直接計(jì)數(shù)法制作標(biāo)準(zhǔn)品和PCR產(chǎn)物制作標(biāo)準(zhǔn)品分別建立熒光定量PCR反應(yīng)體系，以10<'3>個(gè)細(xì)菌/μl為檢測(cè)標(biāo)本，做實(shí)時(shí)熒光定量PCR。細(xì)菌直接計(jì)數(shù)法制作標(biāo)準(zhǔn)品的檢測(cè)結(jié)果為為763.8個(gè)細(xì)菌/μl，PCR產(chǎn)物制作標(biāo)準(zhǔn)品的檢測(cè)結(jié)果為112．9個(gè)細(xì)菌μl/。 5.有三株細(xì)菌表型鑒定和PCR鑒定結(jié)果不一致。 6.基因

6、進(jìn)化樹和Blast結(jié)果表明，同種分離株的16s rNA基因序列之間以及和相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)的16s rNA基因序列之間的遺傳學(xué)距離有一定的差異。 結(jié)論： 1.建立的普通PCR和實(shí)時(shí)熒光定量PCR體系能特異性地檢測(cè)類桿菌，普通PCR的檢測(cè)靈敏性達(dá)到了100個(gè)細(xì)菌基因組/μl，實(shí)時(shí)熒光定量PCR能檢測(cè)到10個(gè)細(xì)菌的基因組DNA/μl。 2.建立的實(shí)時(shí)熒光定量PCR體系有很好的重復(fù)性，批內(nèi)，批間變異系數(shù)都在5﹪以內(nèi)。