田菁根瘤菌中烷基氫過(guò)氧化物酶在抗氧化壓力及共生固氮中的生理作用.pdf

1、根瘤菌與豆科植物能夠共生形成根瘤進(jìn)行固氮，在相互作用過(guò)程中植物會(huì)產(chǎn)生防御反應(yīng)，會(huì)產(chǎn)生一部分活性氧物質(zhì)ROS(reactive oxygen specie)來(lái)阻抗細(xì)菌的侵入。植物進(jìn)行光合作用會(huì)使得體內(nèi)氧化壓力升高，根瘤菌為了在宿主體內(nèi)定殖必須要適應(yīng)植物體內(nèi)氧化壓力的變化，因此會(huì)產(chǎn)生一些過(guò)氧化物酶來(lái)進(jìn)行代謝。此外共生固氮是厭氧反應(yīng)，因此過(guò)氧化物酶的產(chǎn)生對(duì)根瘤菌與豆科植物的共生過(guò)程起到非常重要的作用。田菁固氮根瘤菌(Azorhizobium

2、caulinodans ORS571)與宿主毛萼田菁既可以形成根瘤，同時(shí)又可以形成莖瘤。莖瘤完全暴露在空氣中，且其皮層中含有能進(jìn)行光合作用放氧的葉綠體，因此莖瘤中的類(lèi)菌體更易受到活性氧物質(zhì)的危害。因此研究A.caulinodans ORS571對(duì)過(guò)氧化物的抗性機(jī)制十分重要。
　　在根瘤菌中，過(guò)氧化氫酶可以清除共生過(guò)程中產(chǎn)生的ROS，并將過(guò)氧化氫轉(zhuǎn)化成水和氧。在本研究中通過(guò)生物信息學(xué)分析確定了azc1050和azc1350分別編碼A

3、.caulinodans ORS571中烷基氫過(guò)氧化物酶(AhpC)和烷基氫過(guò)氧化物酶家族蛋白(Bcp)。首先利用同源重組的方法對(duì)這兩個(gè)基因進(jìn)行了框內(nèi)缺失，在體外模擬體內(nèi)環(huán)境進(jìn)行了敏感性實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)中ahpC和bcp缺失株對(duì)有機(jī)氫過(guò)氧化物類(lèi)的物質(zhì)不是特別敏感，它們分別是異丙苯氫過(guò)氧化物(CuOOH)和叔丁基氫過(guò)氧化物(tBOOH)，但對(duì)過(guò)氧化氫(H2O2)表現(xiàn)出較強(qiáng)的敏感性。這表明在所研究的三種過(guò)氧化物中，aHpC、bcp對(duì)H2O2的清除

4、能力強(qiáng)于有機(jī)氫過(guò)氧化物類(lèi)。據(jù)報(bào)道，在大腸桿菌中，ahpC、bcp的缺失株對(duì)過(guò)氧化氫以及有機(jī)氫都表現(xiàn)出一定的敏感性。此外，在大部分細(xì)菌中，這整個(gè)過(guò)程都受到轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白OxyR的調(diào)控，OxyR是屬于LysR家族的調(diào)控蛋白。據(jù)了解oxyR可以激活或者抑制oxyR調(diào)節(jié)子的表達(dá)，包括ahpCF, katG，gorA，grxA，trxC,dps，并且在大腸桿菌Escherichia coli和銅綠假單胞菌 Pseudomonas aeruginos

5、a中AhpC受到OxyR的正調(diào)控。于是構(gòu)建了ahpC的翻譯融合表達(dá)載體，發(fā)現(xiàn)基因oxyR缺失后對(duì)ahpC的表達(dá)量沒(méi)有顯著影響。且加入過(guò)氧化氫誘導(dǎo)兩小時(shí)后再次測(cè)定lacZ活性，發(fā)現(xiàn)結(jié)果與不加過(guò)氧化氫時(shí)活性一致，即oxyR對(duì)ahpC沒(méi)有調(diào)控關(guān)系，并且過(guò)氧化氫對(duì)其不起誘導(dǎo)作用?？梢哉J(rèn)為在田菁根瘤菌中ahpC是低水平的組成型表達(dá)。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)ahpC對(duì)有機(jī)氫過(guò)氧化物敏感，而ohr是細(xì)胞內(nèi)特異性的清除有機(jī)氫過(guò)氧化物類(lèi)的過(guò)氧化物酶，且能夠被Cu

6、OOH誘導(dǎo)，因此本文還研究了兩者在清除CuOOH功能上是否存在功能互補(bǔ)關(guān)系，結(jié)果證明ohr在缺失株ahpC中的表達(dá)量升高約1.5倍，CuOOH誘導(dǎo)后表達(dá)量升高2倍，因此兩者在功能上著實(shí)有互補(bǔ)關(guān)系。
　　此外，本文還研究了ahpC和bcp對(duì)A.caulinodans ORS571與毛萼田菁結(jié)瘤以及共生固氮的影響。由于細(xì)菌在侵染豆科植物時(shí)，豆科植物的根部會(huì)發(fā)生根毛卷曲，因此我們進(jìn)行了根毛吸附實(shí)驗(yàn)，研究結(jié)果表明ahpC和bcp的缺失菌株