抗菌肽Cecropin B-人溶菌酶融合蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)、分離純化及檢測.pdf

1、抗菌肽(anti-bacterial peptides，簡稱ABP)是生物細(xì)胞特定基因編碼產(chǎn)生的一類小分子多肽，是宿主防御病原微生物入侵的重要分子屏障，其生成和釋放是機體炎癥反應(yīng)的組成部分?？咕牟粌H對革蘭氏陰性細(xì)菌和革蘭氏陽性細(xì)菌具有高效廣譜的殺滅能力，而且對某些病毒、真菌和原蟲也具有抑殺作用；同時它對一些腫瘤細(xì)胞具有選擇性殺傷作用，但對正常哺乳動物和昆蟲細(xì)胞卻無明顯的毒副作用。人溶菌酶(human lysozyme)是人體內(nèi)的一種蛋

2、白質(zhì)，具有抗革蘭氏陰性細(xì)菌和抗一些病毒的能力，和人體具有天然相容性。在臨床上應(yīng)用時，它比其它溶菌酶更安全，沒有刺激性和副作用。本實驗的目的是在構(gòu)建好的抗菌肽CecropinB-人溶菌酶融合蛋白工程菌的基礎(chǔ)上，誘導(dǎo)表達(dá)出目的蛋白，并對其進行分離、純化以及活性測定，以期尋找出有利于CB-hLy表達(dá)的條件，及有效的純化途徑，從而得到一種具有更高活性的抗菌和抗病毒的重組蛋白。 抗菌肽和溶菌酶均具有很強且廣譜的抗抑菌活性，這一特性為其基

3、因工程操作帶來諸多不便。我們采用BL21(DE3)pLysS為宿主菌，并且將重組蛋白CB-hLV的表達(dá)視為兩個階段，前一個階段為質(zhì)粒生長階段，采用37℃培養(yǎng)菌體，主要是保證質(zhì)粒的穩(wěn)定性和提高質(zhì)粒的拷貝數(shù)；后一個階段為重組蛋白表達(dá)階段，待菌體生長飽和后，在25℃下低溫誘導(dǎo)重組蛋白CB-hLy的表達(dá)。我們除了對溫度進行考察外，還研究了培養(yǎng)基、誘導(dǎo)時間等因素對蛋白表達(dá)量的影響。實驗結(jié)果表明，在TB培養(yǎng)基中，菌體先在37℃下生長至飽和后，再更換

4、相同體積的新鮮TB培養(yǎng)基，然后轉(zhuǎn)到25℃下低溫誘導(dǎo)4h，上清中的蛋白表達(dá)量就可接近409％。由于目的蛋白帶有6xHis標(biāo)簽，因此可采用鎳離子金屬螯合層析對其進行第一步純化，經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺電泳(SDS-PAGE)分析表明，其純度約為85％，蛋白得率為1.57％。再經(jīng)第二步凝膠排阻柱層析分離后得到目的蛋白純度約為94％，蛋白得率為0.49％。采用瓊脂滲透法對得到的純化產(chǎn)物進行生物活性分析，結(jié)果表明純化產(chǎn)物對金黃色葡萄球菌有良好