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文檔簡(jiǎn)介
1、背景和目的:
子宮頸癌是女性生殖系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一,全球范圍內(nèi)宮頸癌發(fā)病率在女性癌癥中占第三,僅次于肺癌和胃癌,約有90%的宮頸癌死亡病例發(fā)生在發(fā)展中國(guó),嚴(yán)重威脅著女性生命健康。宮頸癌最主要的兩種類型是鱗狀細(xì)胞癌(squamouscellcarcinoma,SCC)和腺癌(adenocarcinoma,ADCA),宮頸鱗癌約占80%左右,近年來(lái)宮頸腺癌的發(fā)病率不斷增加。持續(xù)的高危型人乳頭瘤病毒(highriskhuman
2、papillomavirus,HR-HPV)感染是宮頸癌最主要的致癌因子,其中HPV16和HPV18是最常見的HR-HPV型別。早期蛋白E6和E7是HR-HPV的主要癌蛋白,E6可泛素化水解P53,導(dǎo)致P53依賴的細(xì)胞凋亡和/或衰老的損失,而E7結(jié)合pRB從而導(dǎo)致細(xì)胞周期紊亂。因此,HR-HPV感染可導(dǎo)致細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化和腫瘤的發(fā)展。
1993年Charles等在小鼠成纖維細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了即刻早期反應(yīng)基因(Immediateearl
3、yresponsegeneX-1,IEX-1),作為即刻早期基因(immediateearlygene,IEG)一員,IEX-1可以在多種刺激條件下短暫快速地表達(dá)。這些刺激因子包括生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子、電離輻射、病毒感染和其他類型的細(xì)胞應(yīng)激因素。IEX-1參與細(xì)胞的代謝、增殖、凋亡、分化及細(xì)胞周期調(diào)節(jié)等多種生物學(xué)效應(yīng)。IEX-1在調(diào)節(jié)細(xì)胞周期和凋亡過程中發(fā)揮著復(fù)雜的作用。雖然目前研究已經(jīng)證實(shí)在多種人類惡性腫瘤中IEX-1表達(dá)失調(diào),但在宮頸
4、癌中IEX-1的研究較少,IEX-1在宮頸癌中的表達(dá)情況如何,IEX-1表達(dá)與宮頸HPV感染是否相關(guān)尚不清楚。
本研究將通過免疫組化法分析IEX-1在宮頸癌組織、宮頸上皮內(nèi)瘤變(CervicalIntraepithelialNeoplasia,CIN)組織及正常宮頸組織中的表達(dá)情況,分析IEX-1的表達(dá)與宮頸癌臨床病理關(guān)系,預(yù)測(cè)IEX-1在宮頸癌發(fā)生發(fā)展中的作用。并通過實(shí)時(shí)熒光定量PRC(RT-qPCR)法及WesternBl
5、ot法分析不同HPV感染狀態(tài)的宮頸癌細(xì)胞中IEX-1的表達(dá)差異。RNA干擾(RNAinterference,RNAi)是指在進(jìn)化過程中高度保守的、由雙鏈RNA(double-strandedRNA,dsRNA)誘發(fā)的、同源mRNA高效特異性降解的現(xiàn)象。RNAi法具有高度的序列專一性,通過瞬時(shí)轉(zhuǎn)染siRNA導(dǎo)入細(xì)胞可以特異地使特定基因沉默。我們通過設(shè)計(jì)針對(duì)HPV16E6的siRNA,轉(zhuǎn)染SiHa細(xì)胞,特異性沉默SiHa細(xì)胞中E6的表達(dá),檢
6、測(cè)沉默E6前后SiHa細(xì)胞中IEX-1的表達(dá),以探索IEX-1的表達(dá)與HPV感染的相關(guān)性及其可能涉及的機(jī)制。本課題將為明確宮頸癌變過程中IEX-1的作用及研究其與HPV的相互作用提供理論依據(jù)。
材料與方法:
1.人宮頸癌細(xì)胞株SiHa(HPV16+)、HeLa(HPV18+)、C-33a(HPV-)均由華中科技大學(xué)惠贈(zèng)。收集2010年1月到2014年10月在鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科存檔蠟塊標(biāo)本132份(其中手術(shù)標(biāo)本
7、124例,活檢標(biāo)本8例)。其中正常宮頸29例,年齡32-61歲;CIN46例(Ⅰ級(jí)19例、Ⅱ級(jí)17例、Ⅲ級(jí)10例),年齡29-58歲;宮頸癌57例(鱗癌35例、腺癌22例),年齡27-65歲。宮頸癌根據(jù)FIGO臨床病例分期:Ⅰ期23例,Ⅱ期26例,Ⅲ期6例,Ⅳ期2例。分化等級(jí):高分化13例,中分化18例,低分化26例。
2.免疫組化SP法檢測(cè)IEX-1在正常宮頸組織、CIN組織及宮頸癌組織中的表達(dá)情況,并分析其與臨床病理特征的
8、關(guān)系。
3.以RT-qPCR法檢測(cè)SiHa、HeLa、C-33a宮頸癌細(xì)胞系中IEX-1表達(dá),WesternBlot法檢測(cè)SiHa、HeLa、C-33a宮頸癌細(xì)胞系中IEX-1蛋白質(zhì)表達(dá)。
4.RT-qPCR和WesternBlot法檢測(cè)E6特異性siRNA干擾SiHa細(xì)胞前后SiHa細(xì)胞中E6及IEX-1的mRNA及蛋白表達(dá)水平。
5.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:采用SPSS17.0軟件統(tǒng)計(jì)分析,定性資料比較采用卡方檢驗(yàn)
9、,定量資料比較采用單因素方差分析,以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。兩兩比較采用Bonferroni法檢驗(yàn)矯正檢驗(yàn)系數(shù)。
結(jié)果:
1.免疫組化法顯示:IEX-1在正常宮頸組織、CIN組織和宮頸癌組織中的表達(dá)依次減少,三者之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=75.905,P=0.000<0.017)。IEX-1在宮頸癌組織中的表達(dá)與患者年齡、病理類型及FIGO分期均無(wú)關(guān)(均P>0.05)。IEX-1的表達(dá)與宮頸癌分化程度及肌層
10、浸潤(rùn)深度相關(guān)。分化程度越低,IEX-1蛋白陽(yáng)性表達(dá)率越低(χ2=6.642,P=0.009<0.05);深肌層浸潤(rùn)者IEX-1蛋白陽(yáng)性表達(dá)率明顯低于僅淺肌層浸潤(rùn)者(χ2=5.076,P=0.025<0.05)。
2.RT-qPCR法分別檢測(cè)SiHa細(xì)胞、HeLa細(xì)胞和C-33a細(xì)胞中IEX-1mRNA表達(dá)水平顯示:IEX-1mRNA在C-33a細(xì)胞中表達(dá)(21.652±9.020)高于SiHa細(xì)胞(1.006±0.027)和H
11、eLa細(xì)胞(1.742±0.854)(PSiHa-C-33a=0.003<0.05,PHeLa-C-33a=0.003<0.05)。SiHa細(xì)胞和HeLa細(xì)胞間IEX-1mRNA表達(dá)無(wú)明顯差異(PSiHa-HeLa=0.868>0.05)。
3.WesternBlot法分別檢測(cè)SiHa細(xì)胞、HeLa細(xì)胞和C-33a細(xì)胞中IEX-1蛋白的表達(dá)水平顯示:IEX-1蛋白在C-33a細(xì)胞(18.017±1.351)中表達(dá)高于SiHa細(xì)
12、胞(1.028±0.039)和HeLa細(xì)胞(2.004±0.363)(PSiHa-C-33a<0.001,PHeLa-C-33a<0.001)。SiHa細(xì)胞和HeLa細(xì)胞間IEX-1蛋白表達(dá)無(wú)明顯差異(PSiHa-HeLa=0.152>0.05)。
4.將SiHa細(xì)胞分為干擾組、陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組,干擾組轉(zhuǎn)染入E6特異性SiRNA核苷酸序列,陰性對(duì)照組轉(zhuǎn)入無(wú)義RNA核苷酸序列,空白對(duì)照組使用RNase-freewater代
13、替。轉(zhuǎn)染后用RT-qPCR法分別檢測(cè)干擾組、陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組E6mRNA和IEX-1mRNA表達(dá)水平顯示:E6mRNA在干擾組(0.218±0.106)表達(dá)水平明顯低于陰性對(duì)照組(1.031±0.072)及空白對(duì)照組(1.003±0.015)(P干擾-陰性對(duì)照<0.001,P干擾-空白對(duì)照<0.001),E6mRNA表達(dá)水平在陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P陰性對(duì)照-空白對(duì)照=0.207>0.05)。IEX-1mRNA在
14、干擾組(20.083±0.672)表達(dá)水平明顯高于陰性對(duì)照組(1.613±0.408)及空白對(duì)照組(1.018±0.032)(P干擾-陰性對(duì)照<0.001,P干擾-空白對(duì)照<0.001),IEX-1mRNA表達(dá)水平在陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P陰性對(duì)照-空白對(duì)照=0.304>0.05)
5.轉(zhuǎn)染后用WesternBlot法分別檢測(cè)干擾組、陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組E6、IEX-1蛋白表達(dá)水平顯示:E6蛋白在干擾組(0
15、.184±0.274)表達(dá)水平均明顯低于陰性對(duì)照組(0.692±0.133)及空白對(duì)照組(0.783±0.097)(P干擾-陰性對(duì)照<0.001,P干擾-空白對(duì)照<0.001),E6蛋白表達(dá)水平在陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P陰性對(duì)照-空白對(duì)照=0.184>0.05)。IEX-1蛋白在干擾組(0.672±0.135)表達(dá)水平均明顯高于陰性對(duì)照組(0.137±0.071)及空白對(duì)照組(0.081±0.009)(P干擾-陰性對(duì)
16、照=0.001<0.05,P干擾-空白對(duì)照<0.001),IEX-1蛋白表達(dá)水平在陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P陰性對(duì)照-空白對(duì)照=0.094>0.05)
結(jié)論:
1.IEX-1在宮頸癌組織中表達(dá)減低,其表達(dá)水平與宮頸癌惡性程度呈負(fù)相關(guān),宮頸上皮細(xì)胞中IEX-1的表達(dá)減低或缺失可能參與了宮頸癌的發(fā)生與發(fā)展。
2.IEX-1在宮頸癌細(xì)胞中的表達(dá)水平與HPV感染與否呈負(fù)相關(guān),與感染的HPV型別無(wú)關(guān)
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