IEX-1在宮頸癌中的表達(dá)及其與HPV感染的相關(guān)性.pdf

1、背景和目的：
　　子宮頸癌是女性生殖系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，全球范圍內(nèi)宮頸癌發(fā)病率在女性癌癥中占第三，僅次于肺癌和胃癌，約有90％的宮頸癌死亡病例發(fā)生在發(fā)展中國(guó)，嚴(yán)重威脅著女性生命健康。宮頸癌最主要的兩種類型是鱗狀細(xì)胞癌（squamouscellcarcinoma,SCC）和腺癌（adenocarcinoma,ADCA），宮頸鱗癌約占80%左右，近年來(lái)宮頸腺癌的發(fā)病率不斷增加。持續(xù)的高危型人乳頭瘤病毒（highriskhuman

2、papillomavirus,HR-HPV）感染是宮頸癌最主要的致癌因子，其中HPV16和HPV18是最常見的HR-HPV型別。早期蛋白E6和E7是HR-HPV的主要癌蛋白，E6可泛素化水解P53，導(dǎo)致P53依賴的細(xì)胞凋亡和/或衰老的損失，而E7結(jié)合pRB從而導(dǎo)致細(xì)胞周期紊亂。因此，HR-HPV感染可導(dǎo)致細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化和腫瘤的發(fā)展。
　　1993年Charles等在小鼠成纖維細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了即刻早期反應(yīng)基因（Immediateearl

3、yresponsegeneX-1，IEX-1），作為即刻早期基因（immediateearlygene，IEG）一員，IEX-1可以在多種刺激條件下短暫快速地表達(dá)。這些刺激因子包括生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子、電離輻射、病毒感染和其他類型的細(xì)胞應(yīng)激因素。IEX-1參與細(xì)胞的代謝、增殖、凋亡、分化及細(xì)胞周期調(diào)節(jié)等多種生物學(xué)效應(yīng)。IEX-1在調(diào)節(jié)細(xì)胞周期和凋亡過程中發(fā)揮著復(fù)雜的作用。雖然目前研究已經(jīng)證實(shí)在多種人類惡性腫瘤中IEX-1表達(dá)失調(diào)，但在宮頸

4、癌中IEX-1的研究較少，IEX-1在宮頸癌中的表達(dá)情況如何，IEX-1表達(dá)與宮頸HPV感染是否相關(guān)尚不清楚。
　　本研究將通過免疫組化法分析IEX-1在宮頸癌組織、宮頸上皮內(nèi)瘤變（CervicalIntraepithelialNeoplasia，CIN）組織及正常宮頸組織中的表達(dá)情況，分析IEX-1的表達(dá)與宮頸癌臨床病理關(guān)系，預(yù)測(cè)IEX-1在宮頸癌發(fā)生發(fā)展中的作用。并通過實(shí)時(shí)熒光定量PRC(RT-qPCR)法及WesternBl

5、ot法分析不同HPV感染狀態(tài)的宮頸癌細(xì)胞中IEX-1的表達(dá)差異。RNA干擾(RNAinterference,RNAi)是指在進(jìn)化過程中高度保守的、由雙鏈RNA(double-strandedRNA，dsRNA)誘發(fā)的、同源mRNA高效特異性降解的現(xiàn)象。RNAi法具有高度的序列專一性，通過瞬時(shí)轉(zhuǎn)染siRNA導(dǎo)入細(xì)胞可以特異地使特定基因沉默。我們通過設(shè)計(jì)針對(duì)HPV16E6的siRNA，轉(zhuǎn)染SiHa細(xì)胞，特異性沉默SiHa細(xì)胞中E6的表達(dá)，檢

6、測(cè)沉默E6前后SiHa細(xì)胞中IEX-1的表達(dá)，以探索IEX-1的表達(dá)與HPV感染的相關(guān)性及其可能涉及的機(jī)制。本課題將為明確宮頸癌變過程中IEX-1的作用及研究其與HPV的相互作用提供理論依據(jù)。
　　材料與方法：
　　1．人宮頸癌細(xì)胞株SiHa（HPV16+）、HeLa（HPV18+）、C-33a（HPV-）均由華中科技大學(xué)惠贈(zèng)。收集2010年1月到2014年10月在鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科存檔蠟塊標(biāo)本132份（其中手術(shù)標(biāo)本

7、124例，活檢標(biāo)本8例）。其中正常宮頸29例，年齡32-61歲；CIN46例（Ⅰ級(jí)19例、Ⅱ級(jí)17例、Ⅲ級(jí)10例），年齡29-58歲；宮頸癌57例（鱗癌35例、腺癌22例），年齡27-65歲。宮頸癌根據(jù)FIGO臨床病例分期：Ⅰ期23例，Ⅱ期26例，Ⅲ期6例，Ⅳ期2例。分化等級(jí)：高分化13例，中分化18例，低分化26例。
　　2．免疫組化SP法檢測(cè)IEX-1在正常宮頸組織、CIN組織及宮頸癌組織中的表達(dá)情況，并分析其與臨床病理特征的

8、關(guān)系。
　　3．以RT-qPCR法檢測(cè)SiHa、HeLa、C-33a宮頸癌細(xì)胞系中IEX-1表達(dá)，WesternBlot法檢測(cè)SiHa、HeLa、C-33a宮頸癌細(xì)胞系中IEX-1蛋白質(zhì)表達(dá)。
　　4．RT-qPCR和WesternBlot法檢測(cè)E6特異性siRNA干擾SiHa細(xì)胞前后SiHa細(xì)胞中E6及IEX-1的mRNA及蛋白表達(dá)水平。
　　5．統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：采用SPSS17.0軟件統(tǒng)計(jì)分析，定性資料比較采用卡方檢驗(yàn)

9、，定量資料比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。兩兩比較采用Bonferroni法檢驗(yàn)矯正檢驗(yàn)系數(shù)。
　　結(jié)果：
　　1．免疫組化法顯示：IEX-1在正常宮頸組織、CIN組織和宮頸癌組織中的表達(dá)依次減少，三者之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=75.905，P=0.000<0.017）。IEX-1在宮頸癌組織中的表達(dá)與患者年齡、病理類型及FIGO分期均無(wú)關(guān)（均P>0.05）。IEX-1的表達(dá)與宮頸癌分化程度及肌層

10、浸潤(rùn)深度相關(guān)。分化程度越低，IEX-1蛋白陽(yáng)性表達(dá)率越低（χ2=6.642，P=0.009<0.05）；深肌層浸潤(rùn)者IEX-1蛋白陽(yáng)性表達(dá)率明顯低于僅淺肌層浸潤(rùn)者（χ2=5.076，P=0.025<0.05）。
　　2．RT-qPCR法分別檢測(cè)SiHa細(xì)胞、HeLa細(xì)胞和C-33a細(xì)胞中IEX-1mRNA表達(dá)水平顯示：IEX-1mRNA在C-33a細(xì)胞中表達(dá)（21.652±9.020）高于SiHa細(xì)胞（1.006±0.027）和H

11、eLa細(xì)胞（1.742±0.854）（PSiHa-C-33a=0.003<0.05，PHeLa-C-33a=0.003<0.05）。SiHa細(xì)胞和HeLa細(xì)胞間IEX-1mRNA表達(dá)無(wú)明顯差異（PSiHa-HeLa=0.868>0.05）。
　　3．WesternBlot法分別檢測(cè)SiHa細(xì)胞、HeLa細(xì)胞和C-33a細(xì)胞中IEX-1蛋白的表達(dá)水平顯示：IEX-1蛋白在C-33a細(xì)胞（18.017±1.351）中表達(dá)高于SiHa細(xì)

12、胞（1.028±0.039）和HeLa細(xì)胞（2.004±0.363）（PSiHa-C-33a<0.001，PHeLa-C-33a<0.001）。SiHa細(xì)胞和HeLa細(xì)胞間IEX-1蛋白表達(dá)無(wú)明顯差異（PSiHa-HeLa=0.152>0.05）。
　　4．將SiHa細(xì)胞分為干擾組、陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組，干擾組轉(zhuǎn)染入E6特異性SiRNA核苷酸序列，陰性對(duì)照組轉(zhuǎn)入無(wú)義RNA核苷酸序列，空白對(duì)照組使用RNase-freewater代

13、替。轉(zhuǎn)染后用RT-qPCR法分別檢測(cè)干擾組、陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組E6mRNA和IEX-1mRNA表達(dá)水平顯示：E6mRNA在干擾組（0.218±0.106）表達(dá)水平明顯低于陰性對(duì)照組（1.031±0.072）及空白對(duì)照組（1.003±0.015）（P干擾-陰性對(duì)照<0.001，P干擾-空白對(duì)照<0.001），E6mRNA表達(dá)水平在陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P陰性對(duì)照-空白對(duì)照=0.207>0.05）。IEX-1mRNA在

14、干擾組（20.083±0.672）表達(dá)水平明顯高于陰性對(duì)照組（1.613±0.408）及空白對(duì)照組（1.018±0.032）（P干擾-陰性對(duì)照<0.001，P干擾-空白對(duì)照<0.001），IEX-1mRNA表達(dá)水平在陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P陰性對(duì)照-空白對(duì)照=0.304>0.05）
　　5．轉(zhuǎn)染后用WesternBlot法分別檢測(cè)干擾組、陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組E6、IEX-1蛋白表達(dá)水平顯示：E6蛋白在干擾組（0

15、.184±0.274）表達(dá)水平均明顯低于陰性對(duì)照組（0.692±0.133）及空白對(duì)照組（0.783±0.097）（P干擾-陰性對(duì)照<0.001，P干擾-空白對(duì)照<0.001），E6蛋白表達(dá)水平在陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P陰性對(duì)照-空白對(duì)照=0.184>0.05）。IEX-1蛋白在干擾組（0.672±0.135）表達(dá)水平均明顯高于陰性對(duì)照組（0.137±0.071）及空白對(duì)照組（0.081±0.009）（P干擾-陰性對(duì)

16、照=0.001<0.05，P干擾-空白對(duì)照<0.001），IEX-1蛋白表達(dá)水平在陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P陰性對(duì)照-空白對(duì)照=0.094>0.05）
　　結(jié)論：
　　1．IEX-1在宮頸癌組織中表達(dá)減低，其表達(dá)水平與宮頸癌惡性程度呈負(fù)相關(guān)，宮頸上皮細(xì)胞中IEX-1的表達(dá)減低或缺失可能參與了宮頸癌的發(fā)生與發(fā)展。
　　2．IEX-1在宮頸癌細(xì)胞中的表達(dá)水平與HPV感染與否呈負(fù)相關(guān)，與感染的HPV型別無(wú)關(guān)