肺腺癌細胞上調(diào)MHC-Ⅱ表達與調(diào)節(jié)性T細胞浸潤關(guān)系的研究.pdf

1、目的：肺癌是當前死亡率最高的惡性腫瘤之一。已證實外源性致癌物導致肺部發(fā)生慢性炎癥反應是肺癌發(fā)生的重要途徑之一。慢性炎癥誘導免疫抑制微環(huán)境形成在肺癌發(fā)生中起重要作用,這一腫瘤相關(guān)免疫抑制微環(huán)境包括髓源抑制性細胞(MDSCs),調(diào)節(jié)性T細胞(Tregs)，腫瘤相關(guān)巨噬細胞(TAMs)，調(diào)節(jié)性樹突狀細胞(DCregs)，基質(zhì)細胞和腫瘤細胞。另外, IL-10, PGE2, TGF-β等細胞因子在免疫抑制微環(huán)境中也發(fā)揮重要作用。 研究發(fā)現(xiàn)，肺泡

2、Ⅱ型上皮細胞(alveolar type-Ⅱ cells, AT-Ⅱ)作為肺組織重要的干細胞，在肺組織發(fā)揮重要的免疫調(diào)節(jié)作用。AT-Ⅱ細胞可以上調(diào)MHC-II的表達而發(fā)揮抗原提呈作用，但是由于缺失激活效應性CD4+T細胞所必須的CD80和CD86，AT-Ⅱ細胞只能誘導幼稚CD4+T細胞分化成Tregs，發(fā)揮致肺免疫耐受作用。有研究報道腸上皮細胞高表達MHC-II誘導Tregs細胞分化和浸潤而參與腫瘤的發(fā)生。我們最近研究發(fā)現(xiàn)灌胃黃曲霉毒素

3、G1(AFG1)誘導肺部慢性炎癥反應介導肺癌發(fā)生中，AT-Ⅱ細胞來源的肺腺癌細胞高表達 MHC-Ⅱ，并伴隨著 Tregs細胞的浸潤增加。給予TNF-α體外模擬炎癥環(huán)境，發(fā)現(xiàn)AT-Ⅱ細胞上調(diào) MHC-Ⅱ, COX-2，IL-10和 TGF-β的表達。有文獻報道慢性炎癥可以激活肺組織上皮細胞 NF-κB通路，可能通過調(diào)控Tregs浸潤，促進肺癌發(fā)生。但是，到目前為止AT-Ⅱ細胞在肺癌發(fā)生中的免疫調(diào)控作用還不清楚，AT-Ⅱ來源的肺腺癌細胞是否

4、通過上調(diào)MHC-Ⅱ表達進而參與Tregs分化和浸潤仍需進一步闡明。為進一步揭示肺癌發(fā)生中AT-Ⅱ細胞上調(diào)MHC-Ⅱ表達與Tregs浸潤的關(guān)系，我們收集68例臨床肺腺癌標本和30例肺鱗癌標本，采用免疫組化方法檢測人組織相容性抗原HLA-DR,β2微球蛋白，CD74，炎癥相關(guān)細胞因子TNF-α，IL-6，COX-2以及Tregs細胞標志蛋白FOXP3的表達，并分析腺癌細胞和鱗癌細胞中MHC-Ⅱ的表達與Tregs細胞浸潤的關(guān)系。另外，我們腹腔

5、給予小鼠烏拉坦，構(gòu)建 TNF-α/NF-κB通路介導的慢性炎癥相關(guān)肺腺癌模型，分別檢測癌前病變期（肺慢性炎癥期）和肺腺癌組織中AT-Ⅱ上皮細胞中MHC-Ⅱ表達情況以及和Tregs浸潤情況，在動物整體水平上進一步探討炎癥介導肺腺癌發(fā)生中，AT-Ⅱ細胞來源的肺腺癌細胞高表達MHC-Ⅱ與Tregs浸潤的關(guān)系。
　　方法：⑴采用免疫組織化學方法，檢測68例肺腺癌和30例鱗癌標本HLA-DR、CD74、β2、TNF-α、IL-6、COX-2

6、的表達情況，分析其與臨床病理特征的關(guān)系。分析肺腺癌中 HLA-DR和 FOXP3蛋白表達的關(guān)系，20例肺組織作為對照。統(tǒng)計分析運用SPSS13.0軟件，采用χ2檢驗、Fisher確切概率法及相關(guān)分析。⑵應用烏拉坦誘導的慢性炎癥相關(guān)的肺腺癌小鼠模型，分析在烏拉坦誘發(fā)的炎性肺組織和肺腺癌中 MHC-Ⅱ, CD74, Tregs的特異性標記物FOXP3, TNF-α和 p-NF-κB的表達情況。
　　結(jié)果：⑴HLA-DR、CD74、β2

7、蛋白的陽性反應定位于細胞漿，出現(xiàn)棕黃色顆粒。HLA蛋白在20例正常肺組織中有1例陽性表達，陽性表達率為5％，肺腺癌和鱗癌的陽性表達率分別為57.4%和10%。HLA-DR蛋白的陽性表達率肺腺癌明顯高于鱗癌(P<0.05)。CD74蛋白在20例正常肺組織中有2例陽性表達，陽性表達率為10%，肺腺癌和鱗癌的陽性表達率分別為85.3%和10%。CD74蛋白的陽性表達率肺腺癌明顯高于鱗癌(P<0.05)。β2蛋白在20例正常肺組織中有2例陽性表

8、達，陽性表達率為10%，肺腺癌和鱗癌的陽性表達率分別為67.6%和20%。β2蛋白的陽性表達率肺腺癌明顯高于鱗癌(P<0.05)。⑵肺腺癌HLA-DR蛋白在高/中分化組的陽性表達率為67.4%，明顯高于低分化組的表達率36.4%( P<0.05)，但其表達與患者年齡、性別及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均無關(guān)(P>0.05)。肺鱗癌HLA-DR蛋白表達與患者年齡、性別、腫瘤分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均無關(guān)(P>0.05)。研究結(jié)果顯示，肺腺癌和鱗癌的臨床病理學意

9、義有差異。HLA-DR蛋白過表達與肺腺癌腫瘤分化程度相關(guān)，分化程度越低，表達越低，而與肺鱗癌腫瘤分化程度無關(guān)。肺腺癌和鱗癌CD74、β2蛋白表達與患者年齡、性別、腫瘤分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均無關(guān)(P>0.05)。⑶在腫瘤細胞陽性表達HLA-DR的肺腺癌病例中， FOXP3蛋白陽性表達的淋巴細胞明顯增多，肺腺癌中HLA-DR與FOXP3表達存在正相關(guān)關(guān)系(r=0.396, P=0.001)。結(jié)果表明，肺腺癌細胞高表達 HLA-DR可能促進T

10、regs細胞的分化和浸潤。⑷TNF-α、IL-6、COX-2蛋白陽性反應定位于細胞漿，出現(xiàn)棕黃色顆粒， TNF-α蛋白在20例正常肺組織中有1例陽性表達，陽性表達率為5%，肺腺癌和鱗癌的陽性表達率分別為82.4%和60%。TNF-α蛋白的陽性表達率在肺腺癌中明顯高于鱗癌(P<0.05)。肺腺癌和鱗癌TNF-α蛋白的陽性表達率明顯高于正常肺組織(P<0.05)。IL-6蛋白在20例正常肺組織中有1例陽性表達，陽性表達率為5%，肺腺癌和鱗癌

11、的陽性表達率分別為39.7%和33.3%。兩者之間的表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。COX-2蛋白在20例正常肺組織中有2例陽性表達，陽性表達率為10%，肺腺癌和鱗癌的陽性表達率分別為92.6%和86.7%。兩者之間的表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。⑸肺腺癌和鱗癌TNF-α、IL-6、COX-2蛋白表達與患者年齡、性別、腫瘤分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均無關(guān)(P>0.05)。⑹免疫組化結(jié)果顯示，肺腺癌細胞高表達 Ⅱ型肺泡上皮細胞標志

12、物SP-C，在HLA-DR和CD74陽性表達腺癌細胞上，TNF-α、IL-6、COX-2呈陽性表達。TNF-α與HLA-DR存在正相關(guān)關(guān)系(r=0.459, P=0.000)。研究結(jié)果表明：Ⅱ肺泡上皮細胞來源的肺腺癌細胞高表達炎癥細胞因子TNF-α可能與HLA-DR上調(diào)表達密切相關(guān)。⑺給予烏拉坦處理組小鼠肺炎癥組織切片HE染色表現(xiàn)為：肺泡壁增厚，間隔增寬，出現(xiàn)炎癥細胞浸潤和肺泡上皮增生表現(xiàn)，呈現(xiàn)慢性炎癥反應改變。免疫組織化學染色結(jié)果顯示

13、：烏拉坦組小鼠肺組織中巨噬細胞標志物 CD68，TNF-α和p-NF-κB表達增加。結(jié)果表明腹腔給予烏拉坦可以誘導小鼠肺泡壁慢性炎癥反應。進一步免疫組化結(jié)果顯示：調(diào)節(jié)性 T淋巴細胞標志物FOXP3陽性細胞浸潤增加，肺泡上皮細胞MHC-Ⅱ高表達。提示在烏拉坦誘導的TNF-α/NF-κB通路介導慢性炎癥反應中，AT-Ⅱ細胞上調(diào)MHC-Ⅱ可能與Tregs浸潤密切相關(guān)。⑻給予造模半年后，7例給予烏拉坦誘導半年的小鼠動物模型全部出現(xiàn)肺腺癌，而7例

14、對照組小鼠未見肺腫瘤發(fā)生。免疫組化結(jié)果顯示肺腺癌組織高表達 AT-Ⅱ細胞標志物 SP-C，揭示烏拉坦誘導的肺腺癌細胞來源于AT-Ⅱ;腫瘤細胞同時高表達MHC-Ⅱ，提示AT-Ⅱ細胞上調(diào)MHC-Ⅱ表達可能參與肺腺癌的發(fā)生。在烏拉坦誘導的肺腺癌組織中，腫瘤細胞高表達TNF-α，p-NF-κB和COX-2等炎癥相關(guān)指標，這提示TNF-α/NF-κB信號途徑的激活可能在慢性炎癥促進腫瘤發(fā)生中起到了重要作用。AT-Ⅱ細胞來源的肺腺癌細胞高表達MHC

15、-Ⅱ和CD74，進一步提示炎癥細胞因子可能上調(diào)AT-Ⅱ細胞MHC-Ⅱ的表達而參與肺腺癌的發(fā)生。FOXP3是Tregs細胞的標志性分子。免疫組化結(jié)果顯示，在烏拉坦誘導肺腺癌周邊組織淋巴細胞中FOXP3陽性細胞數(shù)明顯增多，提示炎癥相關(guān)肺腺癌組織中Tregs細胞浸潤增加。綜合以上結(jié)果表明，在烏拉坦誘導肺組織慢性炎癥反應中， TNF-α可能促進AT-Ⅱ細胞高表達MHC-Ⅱ，進而誘導Tregs細胞分化和浸潤，最終參與肺腺癌的發(fā)生。
　　結(jié)論

16、：①人組織相容性抗原HLA-DR及其長鏈蛋白CD74和β2蛋白在肺腺癌組織中表達明顯高于在肺鱗癌組織以及正常組織，提示AT-Ⅱ細胞來源的肺腺癌細胞高表達MHC-Ⅱ。②肺腺癌組織高表達 HLA-DR與T淋巴細胞高表達 Tregs標志物FOXP3具有明顯相關(guān)性，提示肺腺癌細胞高表達HLA-DR可能促進Tregs細胞的分化和浸潤。③Ⅱ型肺泡上皮細胞來源的肺腺癌細胞高表達炎癥細胞因子TNF-α與HLA-DR高表達具有明顯相關(guān)性，腫瘤微環(huán)境中TN

17、F-α可能上調(diào)AT-Ⅱ細胞HLA-DR的表達。④在烏拉坦誘導的 TNF-α/NF-κB通路介導肺慢性炎癥反應中，肺泡上皮高表達MHC-Ⅱ，淋巴細胞中FOXP3陽性細胞數(shù)增加，提示AT-Ⅱ細胞上調(diào)MHC-Ⅱ可能與Tregs浸潤密切相關(guān)。⑤在烏拉坦誘導的 TNF-α/NF-κB通路介導肺慢性炎癥相關(guān)肺腺癌中，AT-Ⅱ細胞來源的肺腺癌細胞高表達 TNF-α，p-NF-κB和 COX-2， MHC-Ⅱ和CD74，肺組織淋巴細胞中FOXP3陽性細