轉(zhuǎn)鐵蛋白受體介導(dǎo)的腦膠質(zhì)瘤靶向siRNA核殼載藥系統(tǒng)及其抗腫瘤作用的評價.pdf

1、腦膠質(zhì)瘤是一種常見的侵襲性原發(fā)惡性腫瘤。腦膠質(zhì)瘤由于其膨脹性和浸潤性的生長特點，造成患者發(fā)病率高、病死率高、治愈率低。目前，臨床首選手術(shù)治療，但由于浸潤生長和易擴散的特點，手術(shù)很難徹底切除腫瘤組織。因此，針對腦膠質(zhì)瘤需要多種治療方法相結(jié)合，其中包括藥物治療。但是，由于腦膠質(zhì)瘤與其他腫瘤疾病相比，由于血腦屏障（BBB）的阻礙，普通藥物很難進入腫瘤組織、殺傷腫瘤細胞。所以，設(shè)計、制備出能穩(wěn)定攜帶藥物跨過BBB的靶向藥物遞送系統(tǒng)成為了腦膠質(zhì)瘤

2、藥物治療的關(guān)鍵。本研究旨在構(gòu)建、制備一種由T7介導(dǎo)的、用于siRNA遞送的核-殼結(jié)構(gòu)腦膠質(zhì)瘤靶向納米粒，并考察其內(nèi)外穩(wěn)定性、安全性、靶向性以及有效性。本研究主要內(nèi)容包括：
　?、臢HS-PEG2000-DSPE與T7通過酰胺反應(yīng)生成具有靶向功能的修飾材料T7-PEG2000-DSPE。利用MALDI-TOF-MS、1H NMR和FTIR對產(chǎn)物進行了結(jié)構(gòu)確證。制備包載siRNA的普通陽離子核殼結(jié)構(gòu)納米粒（LPC/siRNA）、PEG

3、修飾的納米粒（PEG-LPC/siRNA）、T7修飾的靶向納米粒（T7-LPC/siRNA）。所得納米粒平均粒徑在170-190 nm范圍內(nèi)，分布均一，PDI均小于0.3，PEG化后的納米粒Zeta電位由38.63±1.75 mV降至10 mV左右。透射電鏡結(jié)果顯示T7-LPC/siRNA納米粒為圓球或橢球形結(jié)構(gòu)。通過瓊脂糖凝膠電泳實驗證明，三種納米粒均能夠完全包封siRNA。血清保護實驗結(jié)果表明T7修飾的靶向納米粒對siRNA在血清中

4、的保護作用可達36 h以上。在血清穩(wěn)定性實驗中，PEG化納米粒較未經(jīng)任何修飾的 LPC/siRNA納米粒在血清中穩(wěn)定存在，不易發(fā)生聚集現(xiàn)象。T7-LPC/siRNA納米粒在中性條件下，溶血毒性小，不會引起血細胞凝集，酸性條件下，容易破膜，提示其具有溶酶體逃逸能力。通過MTT實驗發(fā)現(xiàn)：PEG的引入明顯降低了陽離子脂質(zhì)復(fù)合載體的細胞毒性。
　?、仆ㄟ^研究包載熒光標(biāo)記siRNA的T7-LPC/siRNA納米粒在單層腦微血管內(nèi)皮細胞（BM

5、VEC）及U87腦膠質(zhì)瘤細胞中的攝取情況，以及跨越體外BBB模型后在U87腦膠質(zhì)瘤細胞的蓄積能力，以評價制劑的靶向性；通過考察T7-LPC/siRNA納米粒不同時間在U87三維腫瘤球內(nèi)的分布情況，研究靶向納米粒對腫瘤球模型的穿透能力?？疾霻7-LPC/siRNA納米粒在U87細胞內(nèi)的入胞途徑、入胞速率以及溶酶體逃逸速率，解釋其細胞內(nèi)化行為。研究結(jié)果表明具有靶向功能的T7-LPC/siRNA納米?？梢燥@著提高siRNA在BMVEC及U87

6、細胞中的攝取量；靶向納米粒可顯著跨越體外BBB模型、并在U87細胞中迅速蓄積；T7-LPC/siRNA納米粒對于U87腫瘤球具有明顯的穿透能力。T7-LPC/siRNA納米粒通過網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的途徑快速進入細胞后，可在較短時間內(nèi)實現(xiàn)溶酶體逃逸，降低siRNA被溶酶體內(nèi)RNA酶降解的幾率。
　　⑶采用腦立體定位技術(shù)，成功建立了原位U87腦膠質(zhì)瘤裸鼠模型，通過活體成像技術(shù)考察載體與藥物雙熒光標(biāo)記的靶向納米粒在荷瘤裸鼠的體內(nèi)分布。活體成像

7、研究結(jié)果顯示：靶向納米粒 T7-LPC/siRNA，在血液循環(huán)中能夠穩(wěn)定存在、成功包裹siRNA跨過BBB、蓄積于裸鼠腦部；在腫瘤部位具有較長的滯留時間。以特異性沉默EGFR基因的siRNA（siEGFR）為模型藥物，通過PCR、ELISA、U87腫瘤球生長抑制實驗，對T7-LPC/siEGFR納米粒的轉(zhuǎn)染效率進行了細胞水平的評價。結(jié)果顯示：靶向納米粒能夠增強EGFR編碼基因沉默效應(yīng)；較非靶向納米粒具有更強的BBB穿透能力，引起更顯著的

8、EGFR蛋白下調(diào)；能顯著抑制U87細胞球生長。
　?、冉⒃籙87腦膠質(zhì)瘤裸鼠模型，分別通過尾經(jīng)脈注射5％葡萄糖、T7-LPC/siNC、PEG-LPC/siEGFR以及T7-LPC/siEGFR納米粒，以生存率、裸鼠體重變化、EGFR蛋白表達量為指標(biāo)，考察納米粒對腦膠質(zhì)瘤的治療效果。并通過給藥過程中裸鼠的血象分析進行初步體內(nèi)安全性評價。結(jié)果顯示靶向納米粒T7-LPC/siEGFR給藥后延長了荷瘤裸鼠生存期，下調(diào)了EGFR蛋白水