高特異性碳納米生物傳感器快速檢測(cè)沙門(mén)氏菌的研究.pdf

1、食源性病原菌是當(dāng)今世界最為普遍的問(wèn)題之一。微生物食品中毒可以由細(xì)菌、病毒、真菌以及原生生物引起，其中絕大部分的細(xì)菌性感染都是由沙門(mén)氏菌引起的。目前，由沙門(mén)氏菌所引發(fā)的禽蛋肉產(chǎn)品的污染以及食物中毒事件已成為制約國(guó)民經(jīng)濟(jì)發(fā)展、危害人類(lèi)健康的嚴(yán)重食品安全問(wèn)題。隨著人們對(duì)食品安全問(wèn)題關(guān)注度的不斷增長(zhǎng)，對(duì)發(fā)展快速、準(zhǔn)確、靈敏、高效的食品安全檢測(cè)技術(shù)提出了更高的要求。然而目前的傳統(tǒng)檢測(cè)方法存在耗時(shí)耗力、價(jià)格昂貴、操作繁瑣、靈敏度不高、特異性不強(qiáng)等局

2、限性，已不能滿(mǎn)足沙門(mén)氏菌快速檢測(cè)技術(shù)發(fā)展的新要求。因此，建立一種簡(jiǎn)單、高效、快速、靈敏的檢測(cè)手段來(lái)監(jiān)控沙門(mén)氏菌就顯得尤為重要。碳納米管基于其獨(dú)特的化學(xué)、電學(xué)、光學(xué)、力學(xué)性質(zhì)在生物傳感器以及藥物傳遞等方面有著非常廣泛的應(yīng)用前景。尤其是近些年來(lái)，碳納米管作為一種廣譜性的熒光猝滅劑已經(jīng)越來(lái)越受到人們的關(guān)注，成為最具發(fā)展前景的納米材料之一。本論文在對(duì)碳納米管性質(zhì)研究的基礎(chǔ)上，結(jié)合分子探針構(gòu)建了基于生物功能化的碳納米管生物傳感器對(duì)沙門(mén)氏菌進(jìn)行檢測(cè)

3、;此外，一種類(lèi)似于碳納米管的碳材料—石墨烯也被應(yīng)用于檢測(cè)沙門(mén)氏菌中ATP的含量。結(jié)果顯示，所構(gòu)建的傳感器具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、穩(wěn)定性好等優(yōu)勢(shì)。最后，鑒于沙門(mén)氏菌形成生物菌膜后難以清除和難以治療的現(xiàn)狀，本論文篩選出一種抑制型適配體用以控制沙門(mén)氏菌菌膜形成，從而拓展了適配體的應(yīng)用范圍?；谝陨锨闆r，具體研究?jī)?nèi)容如下:
　　(1)檢測(cè)含毒力島SSeC基因的鼠傷寒沙門(mén)氏菌。利用碳納米管作為載體和熒光猝滅劑，分子信標(biāo)作為識(shí)別元件，建立了一

4、種全新的快速檢測(cè)含毒力島SSeC基因的鼠傷寒沙門(mén)氏菌的方法。在本檢測(cè)方法中，羧基修飾的碳納米管與一端氨基修飾的分子信標(biāo)在EDC/NHS的作用下脫水結(jié)合形成生物功能化的碳納米管。在沒(méi)有靶標(biāo)的情況下，由于DNA與碳納米管的雙重猝滅效應(yīng)，熒光分子柔紅霉素發(fā)生熒光猝滅;當(dāng)加入靶標(biāo)后，由于靶標(biāo)與環(huán)狀結(jié)構(gòu)結(jié)合導(dǎo)致分子信標(biāo)結(jié)構(gòu)崩解，插入莖狀結(jié)構(gòu)中的柔紅霉素釋放出來(lái)，使得熒光值增強(qiáng)。而加入錯(cuò)配堿基序列，柔紅霉素?zé)晒庵翟鰪?qiáng)的信噪比遠(yuǎn)低于靶標(biāo)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明

5、，通過(guò)檢測(cè)柔紅霉素?zé)晒庵档脑鰪?qiáng)可以對(duì)含有SSeC基因的鼠傷寒沙門(mén)氏菌進(jìn)行定量檢測(cè)，而且此方法具有較高的靈敏性和特異性。在本檢測(cè)體系中，靶標(biāo)的濃度與柔紅霉素?zé)晒庵档脑鰪?qiáng)在0.2-0.7μM的范圍內(nèi)呈良好的線(xiàn)性關(guān)系，并且目標(biāo)DNA的檢測(cè)下限為50nM。
　　(2)檢測(cè)甲型副傷寒沙門(mén)氏菌的研究。通過(guò)酸水解法提取甲型副傷寒的鞭毛蛋白，并以其為靶標(biāo)分子，經(jīng)過(guò)14輪的SELEX篩選，篩選出能夠高親和性、高特異性結(jié)合鞭毛蛋白的適配體群。利用DN

6、AMAN軟件分析其一級(jí)結(jié)構(gòu)的相似性并進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)，根據(jù)二級(jí)結(jié)構(gòu)的相似性以及一級(jí)結(jié)構(gòu)的重復(fù)性，將所選的適配體分為4個(gè)家族。從4個(gè)家族中各挑選出1條適配體并對(duì)其進(jìn)行親和力測(cè)試，通過(guò)比較Kd值，最終篩選出一條最佳的適配體。將該適配體截去部分引物序列并修飾上FITC，同時(shí)在另一端結(jié)合上一段DNA酶序列，并將該探針?lè)枪矁r(jià)結(jié)合到碳納米管上，從而設(shè)計(jì)出一條能夠通過(guò)雙重信號(hào)檢測(cè)甲型副傷寒沙門(mén)氏菌的功能化核酸探針。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，通過(guò)檢測(cè)熒光值的增加

7、以及吸光度的增加可以對(duì)牛奶樣品中的甲型副傷寒沙門(mén)氏菌進(jìn)行定量檢測(cè)，在本檢測(cè)體系中，用熒光信號(hào)以及吸光度所測(cè)出的最低檢測(cè)下限分別為105CFU/mL和106CFU/mL。該方法同時(shí)利用兩種信號(hào)來(lái)檢測(cè)靶標(biāo)物質(zhì)，極大的提高了檢測(cè)的準(zhǔn)確性和可靠性，降低了假陽(yáng)性信號(hào)產(chǎn)生的可能性。這一檢測(cè)方法不僅可以用于檢測(cè)甲型副傷寒沙門(mén)氏菌，也為其它細(xì)菌以及其它物質(zhì)的快速檢測(cè)提供了一種新的思路。
　　(3)基于氧化石墨烯的非標(biāo)記性熒光適配體傳感器快速檢測(cè)A

8、TP的研究。實(shí)驗(yàn)首先證明了該方法的可行性，結(jié)果表明，在只加入信號(hào)探針互補(bǔ)鏈的情況下，熒光信號(hào)并不會(huì)增強(qiáng);只有在同時(shí)加入信號(hào)探針互補(bǔ)鏈和ATP的條件下熒光信號(hào)才會(huì)增強(qiáng)。由此證明，熒光信號(hào)的增強(qiáng)只與加入ATP的多少有關(guān)，因此該體系可以用來(lái)定量檢測(cè)ATP。由檢測(cè)結(jié)果可知，當(dāng)ATP的濃度從1nM到800nM變化，對(duì)應(yīng)的熒光強(qiáng)度隨濃度的增加而增加，其檢測(cè)下限可達(dá)1nM，而且F/F0在10nM到700nM之間呈良好的線(xiàn)性關(guān)系。體系還對(duì)檢測(cè)ATP的特

9、異性作出了探討，將ATP的類(lèi)似物UTP、GTP、CTP作為對(duì)照，由檢測(cè)結(jié)果可知該適配體傳感器對(duì)ATP分子的檢測(cè)具有很強(qiáng)的特異性。相比于其它傳統(tǒng)的檢測(cè)方法，該分子識(shí)別技術(shù)對(duì)ATP的檢測(cè)，不僅靈敏度高，特異性強(qiáng)，而且操作簡(jiǎn)單，成本低廉，穩(wěn)定性好，為其它檢測(cè)方法的開(kāi)發(fā)和利用打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。
　　(4)適配體控制細(xì)菌菌膜形成的研究。以豬霍亂沙門(mén)氏菌為靶標(biāo)，經(jīng)過(guò)14輪的SELEX篩選，篩選出能夠特異性識(shí)別豬霍亂沙門(mén)氏菌的適配體群，并在第十

10、輪和第十一輪分別用甲型副傷寒沙門(mén)氏菌和鼠傷寒沙門(mén)氏菌進(jìn)行反篩，以提高篩選的特異性。經(jīng)親和力檢測(cè)后，確定一條最佳的適配體，將該適配體生物素修飾后并結(jié)合鏈酶親和素修飾磁珠用以垂釣豬霍亂沙門(mén)氏菌表面標(biāo)記分子。經(jīng)質(zhì)譜鑒定后，該適配體特異性結(jié)合的靶標(biāo)為鞭毛蛋白。由鞭毛介導(dǎo)的趨向運(yùn)動(dòng)和起始粘附在早期細(xì)菌生物膜的形成中至關(guān)重要，基于以上事實(shí)，本研究開(kāi)發(fā)出能抑制鞭毛運(yùn)動(dòng)進(jìn)而控制細(xì)菌生物膜形成的功能化適配體。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，經(jīng)抑制性實(shí)驗(yàn)、熒光倒置顯微鏡和原